抗流感病毒B单抗杂交瘤细胞cDNA文库的构建及生物信息学分析

论文摘要

流行性感冒（influenza,简称流感）是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道传染病,是人类面临的主要公共健康问题之一。据统计,流感每年的发病率为10%～30%,其流行病学的特点是:突然暴发,迅速蔓延,播及面广。流感流行具有一定的季节性。我国北方常发生于冬季,而南方多发生在冬夏两季。流感发病率高,人群普遍易感。流感临床症状较重,起病急骤,并发症发生率高,特别是肺炎,可引起死亡,死者大多为年迈体弱和幼年多病或有慢性基础病者。B型流感病毒近年来常造成流感局部区域性暴发。病毒的感染过程其实就是病毒与宿主或机体相互斗争的过程。杂交瘤细胞是一种“1+1>2”的特殊细胞,其分泌抗体的基因源于受到免疫原刺激的宿主免疫细胞――B细胞。她的基因组承载着病原体与宿主相互作用的信息,同时由于整合了肿瘤细胞的“长生基因”,使其成活时间明显延长,而且极有可能产生一些基因的突变和重组,并由此产生一些抗体之外的新物质。因此流感病毒B单抗杂交瘤细胞基因组的研究是一个值得探索的课题。如何迅速、高效的从基因组中获取生物学信息,是一个富有挑战性的课题,EST技术就是基于这种认识而发展起来的。本试验用纯化的Flu B抗原免疫小鼠,拟制备能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研制一种方便、快捷、特异的金标试纸快速诊断方法打下坚实的基础,同时拟构建分泌抗Flu B抗体杂交瘤细胞cDNA文库并测序,获取EST片断,再通过美国国家生物信息中心（National Center Biotechnology Information, NCBI）服务器的UniGene数据库进行BLAST检索,应用sequencher软件对EST序列进行片断重叠群分析,应用生物信息学方法研究杂交瘤基因,为预测和进一步开发杂交瘤细胞的功能提供理论基础。方法和结果:1.应用纯化的B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经过5次免疫、细胞融合、融合细胞的亚克隆,获得了3株能稳定分泌抗B型流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为:3B2,12G3,5A4。3株杂交瘤细胞株染色体计数检测显示接近亲本细胞染色体数目之和。3株单抗的重链均为IgG1型,轻链为κ链,单抗效价较高、与A型流感病毒和RSV均不发生交叉反应。2.应用经典cDNA文库构建方法,经过细胞总RNA的提取、mRNA的分离,以带有多聚腺苷酸的mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,第二链,cDNA双链和载体的连接,转入受体菌,构建成杂交瘤细胞的cDNA文库。该文库库容为1.27×106。3.原始文库中挑选了400个克隆,测序共得到384个序列,测序成功率为96%,将序列编辑后去除载体序列后得到长度在200bp～700bp的有效序列320条。经过BLAST程序对所获得的EST片断进行基因,结果显示有118条序列与数据库中的已知基因有较好的相似性。经过Sequencher 4.8软件将384条EST片断的进行片断重叠群（contig）分析,结果共得到包括71条EST序列在内的25组片断重叠群,占全部EST序列的22.2%,其余249条都属于单拷贝序列。结论:1.成功制备抗B型流感病毒杂交瘤细胞株,为金标法快速诊断B型流感病毒感染奠定了基础。2.抗B型流感病毒杂交瘤细胞cDNA文库的成功构建和部分克隆的测序,对于新基因的克隆和功能研究提供了可用资源,同时对预测和进一步开发杂交瘤细胞的功能提供了良好的物质基础。3.为建立杂交瘤细胞的资源信息库做了重要的开端工作。

论文目录

• 英文缩写一览表
• Abstract
• 中文摘要
• 正文 抗流感病毒B 单抗杂交瘤细胞cDNA 文库的构建及生物信息学分析
• 前言
• 第一部分 分泌抗流感病毒B 单抗杂交瘤细胞的制备及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 流感病毒B 单抗杂交瘤细胞cDNA 文库的构建
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 cDNA 文库EST 获取及初步生物信息学分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述一 反向遗传学技术在呼吸道病毒研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 药物基因组学与NSCLC 辅助化疗
• 参考文献
• 在读期间论文发表情况
• 英文论著