论文摘要
目的:建立一种在骨髓塑料包埋切片上行原位逆转录聚合酶链反应（RT-PCR in situ,原位RT-PCR）技术的方法,明确再生障碍性贫血患儿骨髓组织人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染的组织学依据;通过流式细胞术了解再障患儿骨髓内HCMV活动性感染和骨髓CD34+细胞/有核细胞百分比之间的关系,结合二者探讨骨髓内HCMV活动性感染对再障患儿骨髓造血功能的影响。方法:临床筛选再生障碍性贫血患儿26例,全部除外HBV、HCV、HIV、细小病毒B19、EBV、细菌、药物、结缔组织病及遗传代谢性疾病。①取患儿骨髓活检组织,采用甲基丙烯酸甲酯（MMA）低温塑料包埋方法包埋骨髓活检组织,制备骨髓组织塑料包埋切片;将切片置于Eppendorf管反应液内进行原位逆转录并扩增,于显微镜下原位检测骨髓组织中HCMV mRNA表达。②同时取患儿骨髓液标本,每份分成两部分:一部分骨髓液提取RNA进行逆转录聚合酶链反应并电泳,检测是否有HCMV mRNA表达作为原位RT-PCR的对照。③将另一部分骨髓液进行流式细胞术,检测骨髓CD34+细胞/有核细胞的百分比。④另收集5例其它疾病患儿的正常骨髓液标本做为对照组。结果:①9例（34.6%）骨髓塑料切片检测到HCMV mRNA表达;阳性细胞多为骨髓实质细胞,呈局灶性或片状分布,阳性信号主要位于细胞胞浆内,少量出现在部分细胞的胞核。②普通液相RT-PCR检测11例（42.3%）骨髓液中有HCMV mRNA表达。两种检测方法阳性率差异无显著性意义（P >0.05）,其中原位RT-PCR检测阳性结果的9例患儿抽取骨髓液进行普通液相RT-PCR检测结果均为阳性。5例对照组骨髓均未检测到HCMV mRNA表达。③再障患儿骨髓CD34+细胞/有核细胞的平均百分数为（0.26±0.21）%,明显低于正常对照组水平。其中,再障患儿骨髓HCMV mRNA阳性组的CD34+细胞百分比为（0.13±0.07）%,低于HCMV mRNA阴性组（0.34±0.23）%（P < 0.05）。结论:①改良的原位RT-PCR方法可用于塑料包埋切片的检测,可定位诊断骨髓中HCMV活动性感染,为HCMV活动性感染致血液学改变提供了组织学依据,对再障发病机理的探讨具有重要意义。②HCMV可感染再障患儿骨髓组织,其活动性感染可导致骨髓CD34+细胞/有核细胞的百分比明显减少,提示骨髓HCMV活动性感染对骨髓造血功能有抑制作用,这可能是导致再障发生的原因之一。