TaNHX2基因表达载体、Na～+/H～+反向运转蛋白RNAi载体构建及功能分析

论文摘要

植物在生长发育中时常要受到不良环境的胁迫,如盐渍、干旱、低温等。其中盐胁迫严重影响植物的生长。为了减少盐胁迫造成的伤害,植物在长期进化过程中,形成了一套耐盐的机制,或增加Na+的外排,或限制Na+的吸收,或将Na+束缚在液泡中。目前已经知道有些植物主要通过液泡膜Na+/H+反向运转蛋白将Na+束缚在液泡中以减少Na+的毒害。因此液泡膜Na+/H+反向运转蛋白在植物耐盐性方面具有重要作用。在耕地有限,人口不断增长的今天,培育耐盐能力相对提高的植物品种已成为植物分子育种工程的目标之一。 所以本课题以小麦中TaNHX2为研究对象,构建了含有TaNHX2基因的植物表达载体。构建Na+/H+反向运转蛋白基因的RNA干涉表达载体。采用花粉管通道法成功的获得了转基因拟南芥,并进行了相关的分子生物学鉴定及生理验证。为植物耐逆研究积累相关资料,主要试验方法和结论如下: 1.以植物双元载体pBIN438为基本元件,构建含TaNHX2基因的植物表达载体。利用花粉管通道法将TaNHX2基因导入拟南芥,并获得转基因植株。通过PCR、Southern杂交和RT-PCR鉴定,表明外源基因已经成功整合到拟南芥基因组中,并获得表达。将转基因拟南芥及野生拟南芥分别转到100mmol/LNaCl、150mmol/LNaCl、200mmol/LNaCl的MS培养基,在盐胁迫条件下转基因植株在叶片大小、植株根长、生物量上均优于野生拟南芥。在含3%PEG6000、5%PEG6000、7%PEG6000的MS培养基上,野生拟南芥表现为生长缓慢,转基因拟南芥同样优于野生拟南芥。说明过表达TaNHX2基因提高了转基因拟南芥的耐逆能力。 2.克隆得到拟南芥Na+/H+反向运转蛋白基因的部分片段,构建了抑制Na+/H+反向运转蛋白基因的RNA干涉表达载体。利用花粉管通道法将RNAi载体导入拟南芥,并获得转基因植株。将转基因拟南芥及野生拟南芥分别转到100mmol/LNaCl、150mmol/LNaCl的MS培养基,在盐胁迫条件下转基因植株表现为生长缓慢,主根纤弱;在200mmol/LNaCl的MS培养基上转基因植株叶片几乎停止生长。野生拟南芥在不同浓度盐胁迫下叶片大小、植株根长、生物量上均优于转基因植株。在含3%PEG6000、5%PEG6000、7%PEG6000的MS培养基上,转基因植株表现为生长缓慢,野生拟南芥同样优于转基因植株。说明Na+/H+反向运转蛋白基因的RNAi载体使转基因拟南芥的耐盐和耐旱能力下降。

论文目录

• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 盐分对植物的影响
• 1.1.1 盐分对植物外部形态的影响
• 1.1.2 盐胁迫对膜结构的影响
• 1.1.3 盐分使植物光合作用下降、能耗增强
• 1.1.4 盐胁迫诱导的氧化胁迫对植物的影响
• 1.1.5 盐分造成植物营养亏缺
• 1.1.6 盐分对植物内源激素的影响
• 1.1.7 植物对盐胁迫的生理反应
• 1.2 植物耐盐的机制
• 1.2.1 与渗透稳态有关的物质和基因
• +、Na⁺的稳态有关的蛋白质和基因'>1.2.2 与K⁺、Na⁺的稳态有关的蛋白质和基因
• +区隔化'>1.2.3 Na⁺区隔化
• 1.2.4 其他离子的稳态和区隔化
• 1.2.5 跨膜电化学梯度的重建
• 1.2.6 水分的吸收
• 1.2.7 应答调控分子
• 1.3 RNA干涉的研究进展
• 1.3.1 RNA干涉现象的发现
• 1.3.2 RNA干涉的作用机理
• 1.3.3 RNAi作用的特点
• 1.3.4 RNAi的生物学意义
• 1.3.5 RNAi的应用
• 1.3.6 展望
• 1.4 结束语
• 2.试验材料和方法
• 2.1 试验所涉及的材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 酶及试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细菌的培养和苗种的保存
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3 大肠杆菌质粒的提取（碱裂解法）
• 2.2.4 DNA片段的快速纯化和回收
• 2.2.5 表达载体的构建
• 2.2.6 植物表达载体的农杆菌转化
• 2.2.7 拟南芥的培养方法
• 2.2.8 菌液的准备
• 2.2.9 转基因拟南芥的制备
• 2.2.10 阳性植株的筛选及纯系的获得
• 2.2.11 转基因植物的分子鉴定
• 2.2.12 转基因植物的耐逆性分析
• +／H⁺反向运转蛋白RNAi表达载体的构建'>2.2.13 Na⁺／H⁺反向运转蛋白RNAi表达载体的构建
• +／H⁺反向运转蛋白RNAi表达载体转化农杆菌、转基因拟南芥的获取及耐逆性分析'>2.2.14 Na⁺／H⁺反向运转蛋白RNAi表达载体转化农杆菌、转基因拟南芥的获取及耐逆性分析
• 3.试验结果
• 2正义表达载体的构建及功能分析'>3.1 TaNHX₂正义表达载体的构建及功能分析
• 2的构建'>3.1.1 表达载体pBIN438-TaNHX₂的构建
• 2表达载体的农杆菌转化'>3.1.2 TaNHX₂表达载体的农杆菌转化
• 3.1.3 抗性植株的获得
• 3.1.4 转基因植株的分子鉴定
• 3.1.5 转基因植株的耐逆性分析
• +／H⁺反向运转蛋白RNAi载体的构建及功能分析'>3.2 Na⁺／H⁺反向运转蛋白RNAi载体的构建及功能分析
• +／H⁺反向运转蛋白RANi表达载体pART27-4的构建'>3.2.1 Na⁺／H⁺反向运转蛋白RANi表达载体pART27-4的构建
• 3.2.2 pART27-4表达载体的农杆菌转化
• 3.2.3 抗性植株的获得
• 3.2.4 转基因植株的耐逆性分析
• 4.讨论
• 4.1 引物的设计及PCR反应条件的优化
• +／H⁺反向运转蛋白的研究'>4.2 Na⁺／H⁺反向运转蛋白的研究
• 4.3 RNAi在植物的功能基因学研究
• 总结
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果