黄瓜性别决定基因M的精细定位及转录表达谱分析

论文摘要

性别分化是植物的基本发育过程,由于作物的性别表达类型决定了其育种和栽培的方式,所以控制性别表达具有重要经济意义,黄瓜（Cucumis Sativus L.）具有非常丰富的性别表现类型,是研究植物性别表达的模式植物。黄瓜花有雄花、雌花和两性花三种类型,但幼花蕾最初都是两性花原基,在进一步发育中两性花原基中雄蕊的滞育形成雌花,雌蕊的滞育形成雄花,雄蕊和雌蕊都发育则形成两性花。目前已经明确控制黄瓜性别表达的主效基因位点有F、M和A三个。除遗传因素外,黄瓜性别表达还受环境和激素的调控,长日照、高温、赤霉素促进雄花产生,而短日照、低温、乙烯则促进雌花形成。激素在黄瓜的性别表达中起重要作用。黄瓜性别表达的乙烯控制模型认为：乙烯既促进雌蕊发育,又抑制雄蕊发育。该模型推断,F基因的产物控制乙烯在黄瓜植株分布的部位和浓度,促进雌性的表达；而M基因的产物则控制乙烯信号的识别,在乙烯浓度高于阈值时抑制雄蕊的发育。近年来的研究发现对该模型提供了实验支持：F基因已被克隆,为乙烯合成酶基因家族成员之一,符合其控制乙烯浓度功能的预测；M位点直接介导了乙烯诱导的雄蕊滞育。要进一步验证该模型的真实性,必须要克隆M基因,而M基因的精细定位则是该基因克隆的前提。本研究以近等基因系WI1983G（雌性株,基因型为MMFF）和WI1983H（两性花株,基因型为mmFF）、F1、F2和BC1为材料,通过M基因的精细定位以及转录表达谱分析,为图位克隆M基因、研究其功能奠定基础。而后者又为进一步深入了解乙烯在黄瓜性别表达过程的作用机理,揭示葫芦科作物性别表达的进化史,乃至通过基因工程操纵其它作物的性别表达来加速杂种优势的利用提供理论依据。主要结果如下：1.近等基因系亲本WI1983G全为雌花,WI1983H全为两性花,它们的杂交组合F1代群体单株均开单性雌花（性型表现为雌性株）,单性花对两性花为显性性状。该杂交组合的F2代群体单株的性型分离株数统计表明：638株F2单株当中,其中雌性株473株,两性花株165株,经卡平方测验,F2代雌性株与两性花株的比例符合3：1的分离比（χ2=0.38；p>0.5）；BC1代群体751个单株当中,雌性株373株,两性株378株,符合1：1的分离比（χ2=0.03；p>0.95）,表明两性花是由单基因控制。2.采用高通量AFLP技术,共获得4个与M基因紧密连锁的AFLP分子标记,其中PGGMCCC450/453和PGTMCTA 185分别位于M基因的两侧,共跨度约5 cM。离M基因最近的侧翼标记EACAMCAT202/203和EATGMCAA80与M基因的遗传距离分别是0.9和1.6 cM,最终将M基因定位在2.5 cM以内。3.利用M基因的侧翼标记PGGMCCC450/453和PGTMCTA185,从1984株F2和751个BC1分离群体中筛选出重组单株,然后通过896对AFLP引物组合、2000对SSR引物（来自于中国农业科学院蔬菜花卉研究所功能基因组实验室黄瓜基因组项目）及CAPS（根据黄瓜基因组项目Superscaff序列信息）筛选分析,共获得了AFLP标记6个、SSR标记8个、SCAR标记2个和CAPS标记1个,从而构建了M基因的精细遗传图谱。M基因侧翼最近的两个标记SSR23487和S ME8SA7与M基因之间的遗传距离均为0.1cM,最终将M基因定位在0.2 cM的遗传区间内。另外,通过染色体步移法开发出了一个SNP标记SN1,该标记在2,080个F2和751个BC1分离群体当中没有发生重组事件,也即SN1与M基因共分离。4.对近等基因系（WI1983G和WI1983H）的雌花和两性花cDNA分别进行EST测序,其中雌花199,032条,两性花176,139条。经Phred/Phrap/Consed软件包聚类拼接后共获得一致性序列（contig）23,627条,雌花和两性花的单一序列（singlet）分别是32,521和33,494条。经Blast比对（Nr非冗余数据库）、IDEG.6分析软件的卡平方检验,发现1,256个Unigene的表达量在雌花和两性花间存在显著性差异（p<0.05）。这些差异表达基因涉及到物质转运、能量代谢、信号转导及胁迫相关等诸多方面。此外,还有一些基因功能未知。对雌花和两性花间表达差异显著的1,256个Unigene进行功能注释和GO分类。它们被注释的基因为435个,按照GO分类结果如下：细胞组分,108条,占36%,主要涉及到细胞核、细胞膜、线粒体等6类组分；分子功能,155条,占51%,表现出7类分子活性；生物学过程,39条,占13%,涉及到信号转导、生物合成、代谢等过程。以近等基因系为材料,结合AFLP、SSR等多种分子标记构建了黄瓜性别决定基因M的精细遗传图谱,为后续图位克隆法克隆M基因奠定了基础。本文通过对WI1983G的雌花和WI1983H两性花约38条EST测序,分析了黄瓜性别相关转录表达谱,初步了解了这些基因参与的生物学过程。此外,本研究中获得的部分功能未知的EST,为我们进一步深入研究黄瓜性别表达的调控机理提供更多的相关候选基因资源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 开花植物性别决定研究进展
• 1 性别决定的遗传基础
• 1.1 花发育的形态学特征
• 1.2 花发育的性别决定机制
• 2 性染色体系统与性别决定
• 2.1 异型性染色体
• 2.2 同型性染色体
• 3 遗传因子与性别决定
• 3.1 性别决定基因
• 3.2 性别决定相关基因
• 本论文的研究内容、目的意义及技术路线
• 1 研究目的和意义
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 第二部分 研究报告
• 第二章 黄瓜性别决定基因M的初步定位
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 材料的培养与黄瓜性型的鉴定
• 1.3 基因组DNA的提取
• 1.4 AFLP研究方法
• 1.5 CAPS研究方法
• 1.6 群体AFLP、CAPS数据的收集及连锁分析
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜两性花基因的遗传规律
• 1和F₂单株中的多态性'>2.2 AFLP标记在亲本、F₁和F₂单株中的多态性
• 1和F₂单株中的多态性'>2.3 CAPS标记在亲本、F₁和F₂单株中的多态性
• 2.4 连锁分析及M基因的初步定位
• 3 讨论
• 3.1 目标基因初步定位是构建精细遗传图谱的前提
• 3.2 黄瓜性别决定基因M可能对应于EIN3-like转录因子
• 第三章 黄瓜性别决定基因M的精细定位
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 材料的培养与黄瓜性型的鉴定
• 1.3 基因组DNA的提取
• 1.4 AFLP研究方法
• 1.5 SSR研究方法
• 1.6 CAPS研究方法
• 1.7 SNP研究方法
• 1.8 群体数据的收集及连锁分析
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜两性花基因的遗传规律
• 2.2 AFLP标记
• 2.3 SSR标记
• 2.4 CAPS标记
• 2.5 SCAR标记
• 2.6 SNP标记
• 2.7 群体数据的收集及连锁分析
• 3 讨论
• 3.1 利用近等基因系和AFLP、SSR分析技术筛选紧密连锁标记的有效性
• 3.2 利用紧密连锁标记进行染色体步移,实现图位克隆的可行性
• 3.3 与目标基因紧密连锁分子标记的应用价值
• 第四章 亲本雌花与两性花的表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 黄瓜花总RNA的提取及cDNA的合成
• 2.2 生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 GO术语注释和分类雄蕊滞育相关基因功能的可行性
• 3.2 核糖体蛋白基因参与植物花发育的调控
• 3.3 同源异型基因参与单性花发育的调控
• 3.4 激素信号转导相关基因参与植物的性别修饰
• 3.5 渗透平衡及其它相关基因
• 全文结论
• 本研究创新之处
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的研究论文
• 致谢