共抑制分子BTLA在HIV慢性感染中的特点及与疾病进展的关系研究

论文摘要

T细胞过度活化是HIV-1（以下均简称HIV）慢性感染过程中的一个重要病理特征。近期发现T细胞过度活化与细胞表面共抑制分子如PD-1、CTLA-4和BTLA的表达有密切关系。这些共信号分子途径在T细胞分化的不同阶段、T细胞反应的不同阶段发挥着不同的调节功能,从而维持机体免疫反应处于稳态。近期在对HIV的感染研究中共抑制分子PD-1、CTLA-4和Tim-3受到高度关注。许多研究均发现在HIV、HBV及HCV等慢性病毒感染性疾病中CD4和/或CD8 T细胞功能耗竭与PD-1水平增高有关,体外阻断PD-1信号后可恢复T细胞的功能。近期研究发现CTLA-4也与HIV慢性感染中的CD4 T细胞功能耗竭有关,阻断CTLA-4信号通路后可部分恢复CD4 T细胞的功能。最近发现的共抑制分子BTLA已证实在T细胞免疫耐受中发挥重要作用,并且影响T细胞的活化和T细胞功能,与自身免疫性疾病的发生和疾病进程相关。但BTLA在慢性病毒感染性疾病,尤其是HIV慢性感染中的研究目前还未有报道。那么我们考虑BTLA是否和PD-1、CTLA-4一样参与了HIV慢性感染的发病过程?因此,我们对慢性HIV感染过程BTLA的表达特点、功能意义及与疾病进展的关系进行了研究,以进一步阐明HIV慢性感染的发病机制。我们纳入了85例HIV慢性感染者,根据CD4细胞计数和HIV病毒载量分为三组:长期无进展者（LTNP）、典型进展者（TP）和AIDS患者,并纳入了26例健康人做为对照。通过BTLA在外周淋巴细胞上频率的流式细胞分析,我们发现BTLA主要表达在B细胞,其次在CD4 T细胞、CD8 T细胞、NKT细胞和单核细胞,而弱表达于NK细胞。通过比较HIV慢性感染者和健康者,发现在HIV慢性感染过程中CD4 T细胞和CD8 T细胞上的BTLA表达明显降低,并随着疾病进展呈进行性下降。为了进一步确证这种降低,我们用实时荧光定量PCR检测了BTLA在mRNA水平的表达,发现在慢性HIV感染者（包括TP和AIDS患者）,BTLA mRNA的水平确实比健康对照低。由于PD-1主要调节的细胞是HIV特异性的CD8 T细胞,因此我们也研究了BTLA是否也主要作用于HIV特异性的CD8 T细胞,结果发现不仅HIV特异性的CD8 T细胞上BTLA表达降低,而且CMV-和Flu-特异性的CD8 T细胞上的BTLA也降低,说明BTLA的降低是非HIV特异性的。我们对CD4 T细胞的BTLA表达水平与HIV疾病进展的相关性进行了研究,发现CD4 T细胞上BTLA的表达水平和平均荧光强度与CD4 T淋巴细胞计数呈正相关,而与HIV病毒载量呈负相关。另外,我们还分析了CD4 T细胞上BTLA表达水平与CD38、PD-1、CD127和Ki67等与疾病进程密切相关的免疫学标志的相关性,结果发现CD4 T细胞上BTLA的表达与CD38、PD-1和Ki67的表达呈负相关,而与CD127的表达呈正相关,这进一步显示HIV感染过程中BTLA的进行性下降与疾病进程密切相关。根据CD27和CD45RO可将CD4 T细胞分为naive T细胞（Tnaive）、中央记忆性细胞（Tcm）和效应记忆性T细胞（Tem）等三个亚群,我们也检测了BTLA在这些CD4 T细胞亚群上的表达。发现LTNP患者Tnaive亚群和Tem亚群上BTLA仅有微弱下降,而Tcm亚群几乎无下降。在TP和AIDS患者,BTLA在Tnaive、Tcm和Tem三个亚群上的表达均明显降低,特别是在AIDS患者。另外,我们从mRNA水平也验证了BTLA在这些CD4细胞亚群上的降低。这些结果说明,持续的HIV感染导致了BTLA的持续下降,BTLA的持续下降又导致了na?ve CD4 T细胞比例降低和记忆性CD4 T细胞比例升高。为了调查CD4 T细胞上BTLA的表达是否影响CD4 T细胞的活化状态,我们分析了健康个体中CD4+BTLA+和CD4+BTLA– T细胞的表型特征,发现BTLA+的CD4 T细胞总体表现出幼稚的表型,即Tniave细胞所占比例最高,而Tcm和Tem所占比例较低。BTLA–的CD4 T细胞总体表现出成熟的表型,主要表现在Tnaive细胞所占比例较低,Tcm和Tem占了大多数。在HIV感染者中虽然BTLA+和BTLA–的CD4 T细胞表现出和健康个体较相同的特征,但BTLA+的CD4 T细胞中Tnaive细胞比健康个体比例要低,尤其在AIDS患者,Tnaive细胞比例更低。这些结果提示持续的HIV感染可能改变了BTLA+ CD4 T细胞中初始T细胞和记忆T细胞的组成。进一步分析BTLA+和BTLA– CD4 T细胞上BTLA和细胞活化标志CD38、凋亡标志Fas（CD95）、细胞功能耗竭标志PD-1、功能效应分子穿孔素（perforin）,以及细胞增殖标志Ki67的关系发现,HIV慢性感染者BTLA+ CD4 T细胞表达CD38、PD-1、CD95、perforin和Ki67均有明显升高,而表达CD127明显降低,尤其在TP和AIDS患者这种变化更为明显。但是在BTLA– CD4 T细胞上,除了CD38在HIV慢性感染者中表达升高外,其他上述免疫学标志几乎无变化,说明在慢性HIV感染过程中BTLA+ CD4 T细胞分化、成熟等方面比BTLA– CD4 T细胞受到的影响更为明显。我们在研究中发现在体外加入HIV-1 NL4-3病毒颗粒能够使CD4 T细胞上的BTLA表达降低,而且这种降低与加入的病毒量有量效关系,加入逆转录酶抑制剂齐多夫定后不能逆转BTLA的降低,说明HIV诱导的BTLA表达下降并不是通过HIV基因去影响BTLA的表达,这种调节很可能发生在HIV进入或吸附细胞表面阶段,或HIV分泌的某种蛋白调节了BTLA的下降。体外功能实验显示,用刺激性抗体交联BTLA后,与健康对照相比TP/AIDS患者BTLA对CD4 T细胞活化和分泌细胞因子的抑制功能均受到损伤,这种抑制功能的降低可能是TP/AIDS患者上BTLA表达下降引起的。因此BTLA对CD4 T细胞抑制功能的降低可能是AIDS患者体内免疫系统过度活化的原因之一。以往对人和小鼠的研究表明BTLA对TCR诱导的T细胞增殖有抑制作用,但我们的研究显示,用刺激性抗体交联BTLA后,BTLA对T细胞的增殖表现出较大的异质性,在不同个体可能表现出不同的作用,或者抑制或者促进增殖。在今后的实验中,将进一步明确BTLA对T细胞增殖的影响。一些研究已经报道了PD-1+ T细胞更容易自发凋亡,我们考虑BTLA介导的信号途径是否对CD4 T细胞的凋亡也有作用。通过对HIV慢性感染者的研究发现,凋亡的CD4 T细胞（即annexin V+ CD4 T细胞）主要是BTLA–细胞,而BTLA+细胞很少有凋亡,且BTLA的表达水平与CD4 T细胞的自发性凋亡呈明显负相关,这些结果显示在HIV感染者中BTLA–CD4 T细胞比BTLA+CD4 T细胞更易发生凋亡。总之,我们的研究结果显示随着HIV慢性感染疾病进展,CD4 T细胞上BTLA表达逐渐下降,而且BTLA介导的对CD4 T细胞的抑制功能受到损伤,BTLA的功能损伤可能导致了机体的免疫过度活化,免疫活化则有利于HIV的复制,最终促进了疾病的进展。这些结果对于阐明BTLA在HIV慢性感染中的致病机制具有重要意义,也为今后人类治疗HIV感染提供了新的靶点。

论文目录

• 缩略词索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一部分 BTLA 与HIV 慢性感染疾病进程的相关性研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 BTLA 在HIV 慢性感染中的功能研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读学位期间发表文章
• 致谢