生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌三元融合子构建及RAPD分析

论文摘要

本研究将能杀灭部分寄生虫的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thudngie）、能净化水质、增强水产动物免疫力、促进鱼类生长的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtili5）和分解纤维素的生孢噬纤维菌（Sporooytophaga myxococcoides），进行原生质体融合，希望得到具有三亲本优良特性于一体的益生菌。通过筛选最终得到一株具有产生芽孢、水解淀粉、降解纤维素，产生植酸酶的多功能融合子。主要结果如下：1．从土壤中分离纯化苏云金芽孢杆菌，并对物理生化特性进行鉴定。结果获得了一株产芽孢能力较强的苏云金芽孢杆菌菌株BS-12。2．分别对枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌的二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12进行生长曲线测定，结果显示BS-12和BP-1对数生长中后期分别为6.0小时、7.0小时。3．利用单因素试验探讨影响苏云金芽孢杆菌BS-12和二元融合子BP-1原生质体的形成率和再生率的因素，结果显示葡萄糖、甘氨酸和青霉素能影响原生质体的形成和再生；BS-12、BP-1最佳溶菌酶浓度分别为6.0 mg／mL，5.0 mg／mL；最佳酶解时间分别为60分钟，60分钟。在最佳优化体系下，BS-12菌株的原生质体形成率和再生率分别82.7％，32.4％；二元融合子BP-1菌株为84.6％，34.6％。4．用热灭活的方法对苏云金杆菌BS-12原生质体进行灭活处理，用紫外线对二元融合菌株BP-1进行灭活处理，结果显示：BS-12原生质体在60℃下灭活时间25分钟，原生质体的死亡率为100％；BP-1原生质体用紫外灭活5min，死亡率达100％。5．在PEG6000和Ca2+存在下，立即将BS-12和BP-1的原生质体在37℃水浴箱中融合60min，再进行融合子筛选。在再生培养基上获得68株三元融合子，连续传代10代，获得一株较稳定的三元融合子FM-20-1。6．比较亲本及融合子菌落表型，显微形态，生化特性，酶活鉴定，对融合子进行初步鉴定。7．对三元融合子FM-20-1、二元融合子BP-1、苏云金杆菌BS-12、生孢噬纤维菌、枯草芽孢杆菌进行随机扩增DNA多态性（RAPD）分析，结果显示三元融合子FM-20-1跟BP-1、BS-12、生孢噬纤维菌和枯草芽孢杆菌都有共同的条带，其遗传距离FM-20-1跟BP-1最近。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.研究目的和意义
• 2.微生态制剂的国内外研究现状及在水产上的开发利用
• 2.1 微生态制剂的国内外研究现状
• 2.2 微生态制剂在水产养殖上的应用
• 3.苏云金芽孢杆菌的研究现状
• 4.灭活原生质体融合技术的研究概况
• 第二章 苏云金芽孢杆菌的分离纯化和筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基
• 1.2 土样
• 1.3 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 菌株分离结果
• 2.2 培养特性
• 2.3 不同蛋白胨与蔗糖含量及CaCO3加入对菌体生长与芽孢形成的测定
• 3.讨论
• 第三章 三元融合子的构建方法与条件
• 1 材料与方法
• 2.方法
• 2.1 菌种培养
• 2.2 两亲本菌株生长曲线的测定
• 2.3 原生质体的制备
• 2.4 原生质体灭活
• 2.5 原生质体的融合及再生
• 2.6 融合子的检出
• 2.7 原生质体形成率、再生率和融合率的计算
• 3 结果与分析
• 3.1 二元融合子BP-1和苏云金芽孢杆菌BS-12对数生长期的选择
• 3.2 葡萄糖、甘氨酸、青霉素对原生质体形成率和再生率的影响
• 3.3 溶菌酶浓度和酶解时间与原生质体形成的关系
• 3.4 原生质体灭活时间和温度的选择
• 3.5 原生质体融合及融合子的检出
• 4 讨论
• 4.1 培养基
• 4.2 菌体的对数生长期
• 4.3 制备预处理及制备液的组成
• 4.4 酶浓度
• 4.5 酶解温度及pH值
• 4.6 酶解时间
• 4.7 渗透压稳定剂
• 4.8 原生质体的保存对再生的影响
• 4.9 PEG的分子量及浓度
• 4.10 PEG处理的时间及温度
• 4.11 处理后培养时间及方式
• 第四章 融合子的生物学特性研究
• 1.实验方法
• 1.1 菌株形态学观察
• 1.2 融合子及亲本菌株的生理生化特性鉴定
• 2.结果与分析
• 2.1 融合子的形态特征
• 2.2 融合子的生理生化特征
• 3.讨论
• 第五章 节融合子及亲本菌株的RAPD分析
• 1.材料
• 1.1 实验菌种
• 1.2 主要试剂和药品
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 主要耗材
• 1.5 主要试剂配制
• 2.实验方法
• 2.1 菌种DNA的抽提
• 2.2 菌种基因组DNA的检测
• 2.3 数据统计析
• 3.结果与分析
• 3.1 三元融合子、二元融合子与其三种亲本菌种的DNA图谱
• 3.2 三元融合子、二元融合子与其三种菌种的遗传配型分析
• 4.讨论
• 4.1 关于RAPD-PCR反应体系与条件的优化
• 4.2 关于RAPD技术及融合子和亲本菌株的遗传关系分析
• 结论和后续工作
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 英文缩写符号说明