建鲤BMP15、BMP2B基因克隆及其表达分析

论文摘要

建鲤,作为我国最主要的鲤鱼养殖品种之一,因其肉质肉味好,饲料转化率高,性温顺,易驯养、易起捕,适应性和抗病力强,能自繁自育,遗传性状稳定等优点,备受消费者、养殖户的青睐。但为具有肌间刺对其深加工造成了影响,从而影响了其经济价值。BMP基因与骨质形成发生有关,在修复骨质缺损和促进骨折愈合等发挥重要作用,但对鱼类肌间刺的形成、发生机制、分布等是否有作用还不清楚。因此,本文以建鲤为研究对象,利用RT-PCR和实时荧光定量PCR等技术,探讨BMP家族中的BMP15和BMP2B基因在建鲤脑、心脏、脾脏、肝脏、卵巢、鳃、肠和肌肉8个组织的mRNA水平的表达,寻求BMP15、 BMP2B基因与鱼类肌间刺的关系。主要研究结果如下：1克隆了BMP15基因的全长cDNA序列,BMP2B基因的部分片段序列,分别为1727bp和948bp,预测氨基酸序列,分别编码359和266个氨基酸。氨基酸序列与Genebank中其它物种的该基因的氨基酸同源性均较高。2对获得的BMP15基因编码的氨基酸序列分析发现：这段氨基酸序列含有TGF-p结构域；该蛋白疏水性最大值为2.711；蛋白质跨膜结构分析显示,含有一个跨膜结构域；蛋白信号肽预测,存在一个信号肽切割位点；对二级结构进行预测,结果二级结构组成中,无规则卷曲（coil）占比例最大,达65.74%,α-螺旋（Alpha-Helix）为21.70%,p-折叠（Beta-Strand）最少为13.09%；BMP15蛋白质最大可能位于线粒体；有14个Ser,6个Thr,3个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点；对糖基化位点进行分析,结果存在一个N-糖基化位点,而无O-糖基化位点。对获得的BMP2B基因编码的氨基酸序列分析发现：这段氨基酸序列含有两个低组成复杂性结构域和一个TGF-β结构域；该蛋白疏水性最大值为1.689；蛋白质跨膜结构分析显示,不存在跨膜结构域；蛋白信号肽预测,存在一个信号肽切割位点；对二级结构进行预测,结果二级结构组成中,无规则卷曲（coil）占比例最大,达60.90%,p-折叠（Beta-Strand）为30.45%,α-螺旋（Alpha-Helix）最少为8.65%；BMP2B蛋白质最大可能位于细胞质；有7个Ser,0个Thr,3个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点；对糖基化位点进行分析,结果存在一个N-糖基化位点,而无O-糖基化位点。3系统进化树分析显示：建鲤BMP15首先跟异育银鲫BMP15聚在一起,然后跟斑马鱼、欧洲海鲈BMP15聚在一起,而哺乳动物BMP15也明显的聚在一起,然后共同聚在一起,可以看出建鲤BMP15首先跟几个鲤科鱼类BMP15聚在一起,说明亲缘关系是较近的。建鲤BMP2B首先跟同属于鲤科的斑马鱼BMP2B聚在一起,也说明跟斑马鱼的亲缘关系是最近的。各个物种的鱼类BMP2B聚在一起,而哺乳动物BMP2B也明显的聚在一起,明显的分为两大枝。4.实时荧光定量PCR结果显示：建鲤BMP15基因在8个组织中都有表达,但表达水平不一样。在卵巢中表达量最高,在肝脏、肌肉中其次,呈中度表达,再次是肠、脑和鳃,在心脏和脾脏中的表达量最低；BMP2B基因也在8个组织中均有表达,但表达水平不一样。在肌肉中的表达量最高,在卵巢、肝脏中其次,呈中度表达,再次是脾脏、鳃和肠,在心脏和脑中的表达量最低。本文运用RT-PCR和RACE技术,首次成功克隆了建鲤BMP15和BMP2B基因,并对其作了组织表达谱分析,为进一步研究BMP15和BMP2B基因的功能、调控奠定了基础,也为进一步研究鱼类肌间刺的形成发生机制提供分子生物学资料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 建鲤概述
• 1.1 建鲤的特点
• 1.2 建鲤的存在的问题
• 2 鱼类肌间刺研究进展
• 2.1 肌间刺分类
• 2.2 肌间刺形态分布
• 2.3 肌间刺形态发育
• 2.4 作用研究
• 3 TGF-β超家族概述
• 3.1 TGF-β超家族
• 3.2 TGF-β超家族的结构特征
• 3.3 TGF-β生物学作用
• 4 骨形态发生蛋白（BMPs）概述
• 4.1 骨形态发生蛋白的发现
• 4.2 BMPs的组成与结构
• 4.3 BMPs的生物学功能
• 4.4 BMPs的信号转导
• 5 BMP15的研究现状
• 5.1 BMP15的结构
• 5.2 BMP15与GDF9之间的协调作用
• 5.3 BMP15、GDF9的信号通路
• 5.4 BMP15的表达
• 6 BMP-2的研究现状
• 6.1 BMP-2基因的结构
• 6.2 BMP-2基因的作用
• 6.3 BMP-2的信号通路
• 6.4 BMP-2基因的表达
• 7 实时荧光定量PCR概述
• 7.1 实时荧光定量PCR分类
• 7.2 实时荧光定量PCR的特点及应用
• 7.3 实时荧光定量PCR数据分析
• 7.4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景
• 8 本试验的研究目的和技术路线
• 8.1 本试验的研究目的
• 8.2 试验技术路线
• 第二章 建鲤BMP15基因和BMP2B基因克隆及其序列分析
• 1 材料
• 1.1 组织样品采集
• 1.2 试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 总RNA的提取及其反转录
• 2.2 建鲤BMP15和BMP2B基因中间片段扩增
• 2.3 建鲤BMP15基因和BMP2B基因的3'RACE扩增
• 2.4 建鲤BMP15基因5'RACE扩增
• 2.5 序列测定及其分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA质量检测
• 3.2 克隆序列的遗传及生物信息学分析
• 3.3 讨论
• 第三章 建鲤BMP15、BMP2B基因实时定量分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 总RNA的提取及其cDNA的合成
• 2.2 real-time PCR结果
• 2.3 熔解曲线分析
• 3 荧光实时定量PCR结果及分析
• 3.1 荧光实时定量PCR的结果
• 3.2 讨论
• 3.3 小结
• 全文结论
• 1 本研究的主要结论
• 2 本研究的主要创新点
• 参考文献
• 附录 实验试剂及配置
• 致谢
• 攻读学位期间发表或已接收的学术论文