hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究

论文摘要

目前无论治疗与否,晚期卵巢癌患者的预后都不佳。在美国,每年大约有26 600例卵巢癌新患者,而每年直接死于卵巢癌的患者约14 500例。据统计,全世界卵巢癌总发病人数大约每年19.1万,而由于卵巢癌疾病的隐匿性,仅仅只有23%的卵巢癌患者能在病变早期被诊断出来。晚期卵巢癌患者虽然接受了综合治疗,但是从确诊之日起,5年存活率不超过30%,所以卵巢癌又通常被称为无声杀手（silent killer）。因此临床上迫切需要特异有效的治疗方法,以期改善晚期卵巢癌患者的预后。研究认为,血管形成（Angiogenesis）在肿瘤的生长和转移过程中起着关键的作用。如果没有肿瘤的血管系统发生,实体肿瘤超过几个毫米将不能生长。此外,血管形成的越密集,肿瘤生长的速度就越快,转移的可能性就越大。在血管生成过程中,Ⅳ型胶原（TypeⅣcollagen）扮演重要角色。Ⅳ型胶原是构成血管基底膜的主要成分之一,能促进细胞的黏附、迁徙、分化、生长。研究认为,Ⅳ型胶原是一个可以调节肿瘤血管形成的潜在治疗靶点。人血管能抑素Canstatin,是继endostatin之后新发现的一个内源性血管生成抑制因子（endogenous inhibitor of angiogenesis）,来源于血管基底膜Ⅳ型胶原α2链C末端球形非胶原区（noncollagenous domain of collagen typeⅣα2-chains,non-collagenous1,NC1）。NC1区参与α链的组装,对Ⅳ型胶原三聚体的形成起关键作用,影响着血管基底膜的形成,而血管基底膜对于新血管形成是非常重要的。关于canstatin基因的研究已阐明,canstatin能抑制血管内皮细胞的生长和迁移,诱导肿瘤细胞凋亡,通过抑制肿瘤血管形成而有效抑制肿瘤移植瘤的生长。有关研究表明,肿瘤移植瘤内系统注射canstatin基因重组子能有效的抑制体内异体胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌移植瘤的生长。然而,Canstatin基因对人卵巢上皮性癌是否有效,国内外尚未见报道。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。研究认为,人端粒酶逆转录酶（humantelomerase reverse transcriptase,hTERT）基因的活性在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要作用,并且在癌症的基因治疗中已经成为一个新的治疗靶点。有大量的证据表明hTERT基因核心启动子作为启动子可以调控治疗多种实体肿瘤,包括结肠癌、肺癌、肝癌及前列腺癌、卵巢癌等。研究表明hTERT启动子调控的腺病毒复制主要集中在肿瘤细胞内,而对端粒酶阴性的正常细胞不起作用。为了探讨canstatin基因对人卵巢上皮性癌移植瘤的疗效,并使canstatin基因治疗具有靶向性,该课题构建hTERT基因核心启动子调控的Canstatin基因重组腺病毒（Adxsi-GFP-hTERT-Canstatin,AdhTERT-Can）,体外通过Lipofectamin介导转染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞株,研究其对卵巢癌细胞生长的影响,同时建立裸鼠移植瘤动物模型,研究重组腺病毒AdhTERT-Can对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用,以期为卵巢癌canstatin基因靶向治疗提供理论依据。本实验分为以下两部分:第一部分人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子canstatin基因重组腺病毒载体的构建方法1.从卵巢浆液性囊腺癌组织中提取总RNA和基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增canstatin基因片段,PCR方法扩增hTERT基因片段。2.XhoI酶切Canstatin和hTERT扩增片段,使其形成粘性末端,在T4 DNA连接酶的作用下,与pMD18T载体进行连接,将canstatin基因片段和hTERT基因片段同时克隆入pMD18T载体中,获得pMD18T-hTERT-Canstatin载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,酶切、电泳鉴定及测序,将核苷酸序列与基因库进行比较。3.将hTERT-Canstatin片段从pMD18T-hTERT-Canstatin载体切下连接到pShuttle-EGFP-BGHPolyA穿梭载体上,转化感受态大肠杆菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,进行酶切、电泳鉴定。4.将hTERT-Canstatin片段从pShuttle-hTERT-canstatin穿梭载体上转移到腺病毒pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-hTERT-Canstatin（pAdhTERT-Can）重组腺病毒载体,转化感受态细菌DH5α,抗生素筛选,摇菌,提取,酶切、电泳鉴定。5.复苏人胚肾细胞株HEK293细胞,进行培养、传代;线性化处理重组腺病毒载体pAdhTERT-Can,在Lipofectamin介导下转染HEK293细胞,反复冻融,获得重组腺病毒颗粒AdhTERT-Can,借助绿色荧光蛋白（GFP）的表达观察重组腺病毒的表达。重复感染、收集、冻融步骤,扩增重组腺病毒颗粒AdhTERT-Can,用空斑形成实验测定病毒滴度,以pfu（空斑形成单位）计量病毒滴度。结果1.Canstatin和hTERT基因片段扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外线透射仪下观察,约684bp处可见清晰条带,与目的基因canstatin cDNA长度一致;332bp处可见清晰条带,与目的基因hTERT核心启动子DNA长度一致。2.将canstatin基因片段和hTERT基因片段同时克隆入pMD18T载体中,经过细菌转化和抗生素筛选,阳性克隆经过双酶切,电泳获得二条条带:pMD18T载体和目的基因canstatin-hTERT的连接片段。证实扩增片段已插入载体中。经过DNA测序鉴定目的基因序列和基因库的基因序列完全同源。3.将hTERT-Canstatin片段从pMD18T-hTERT-Canstatin载体连接到pShuttle-EGFP-BGHPolyA载体上,经过细菌转化和抗生素筛选,酶切,电泳鉴定,得到1kbp/4.5 kbp两条带,说明穿梭载体构建成功。4.将hTERT-Canstatin片段从pShuttle-hTERT-Canstatin转移到pAdxsi载体上,经过细菌转化和抗生素筛选,酶切,电泳鉴定,得到14Kbp/11.8Kbp/5.1Kbp/2.47Kbp/1.45Kbp/0.6Kbp/0.49Kbp七条特异性条带,说明已得到pAdhTERT-Can重组腺病毒载体。线性化处理pAdhTERT-Can,在Lipofectamin介导下转染HEK293细胞,用荧光显微镜观察,借助报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达,可见大部分包装细胞发出绿色荧光。提示hTERT基因启动子调控的canstatin基因腺病毒载体AdhTERT-Can已成功构建。经过HEK293细胞扩增后,最终获得1.6×1011PFU/ml的病毒,能够满足接下来的体内外实验。第二部分重组腺病毒AdhTERT-Can体外感染卵巢上皮性癌细胞株HO8910PM实验及其体内抑瘤实验方法1.重组腺病毒AdhTERTCan感染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞,借助GFP的荧光表达,用荧光显微镜观察卵巢癌细胞转染情况。2.收集转染细胞,RT-PCR扩增,电泳检测感染HO8910PM细胞中canstatin基因的表达情况。3.用流式细胞仪检测AdhTERT-Can病毒感染对HO8910PM细胞生长周期的影响。4.建立裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤动物模型,当肿瘤直径长至约5mm×5mm时,将荷瘤裸鼠随机分3组:AdhTERT-Can（尾静脉注射AdhTERT-Can上清夜）、Ad-Can（尾静脉注射Ad-Can上清夜）和PBS组（尾静脉注射PBS）,每组6只。共注射2次,间隔72小时。5.测量肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积。用肿瘤的体积大小作为评价靶基因抑制肿瘤生长效果的指标。6.实验结束时处死荷瘤裸鼠,取出移植瘤,行免疫组化（Flk-1、caspase-3、CD105）和HE染色检查。caspase-3和Flk-1用做探讨cantatin基因抑制肿瘤生长机制的指标。7.CD105用做检测微血管密度的指标。8.统计学处理:计量资料均采用均数±标准差表示（（?）±s）,免疫组化数据的统计分析采用x2检验。组间计量资料比较采用ANOVA分析,应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,检验标准α=0.05。结果1.重组腺病毒AdhTERT-Can感染卵巢上皮性癌HO8910PM细胞,用绿色荧光显微镜观察,可见大部分卵巢上皮性癌细胞在荧光激发下,发出绿色荧光,提示卵巢癌细胞感染成功。2.收集感染HO8910PM细胞,RT-PCR扩增后,经2%琼脂糖凝胶电泳,约684bp处可见清晰扩增条带,证实卵巢癌细胞感染成功。3.流式细胞仪上机检测分析,AdhTERT-Can组和Ad-Can组和空白组细胞生长周期比较无明显变化,说明AdhTERT-Can病毒在体外对卵巢上皮性癌细胞生长周期无明显影响。4.裸鼠皮下注射HO8910PM细胞14d后,可观察到接种部位皮下长出小米粒大小硬结,成瘤率100%,提示人卵巢上皮性癌裸鼠异体移植瘤动物模型已成功建立。5.治疗后第8天肿瘤体积开始出现明显差异,AdhTERT-Can组肿瘤体积最小,随后差异越来越明显,P＜0.01。结果提示:通过尾静脉注射,重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显地抑制裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对裸鼠卵巢上皮性癌移植瘤生长的抑制作用具有靶向性。6.AdhTERT-Can治疗组caspase-3的表达明显高于Ad-Can和PBS,而Flk-1的表达明显低于Ad-Can和PBS,P＜0.05,说明重组腺病毒AdhTERT-Can抑制人卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能是:诱导肿瘤组织表达凋亡效应因子caspase-3,增加肿瘤细胞的凋亡;降低Flk-1的表达,抑制肿瘤的血管生成。7.CD105阳性颗粒主要定位于毛细血管、小静脉和小动脉血管内皮细胞膜或细胞浆,成棕黄色颗粒状,MVD计数AdhTERT-Can、Ad-Can和PBS组分别为9.86±3.21/mm2、15.54±4.67/mm2、18.43±6.55/mm2（P＜0.05）。血管主要位于肿瘤的边缘部位。CD105表达在AdhTERT-Can治疗组明显减少,微血管密度降低,提示:重组腺病毒AdhTERT-Can能够通过抑制肿瘤的血管生成而抑制卵巢癌移植瘤的生长。8.HE染色病理切片观察到各组肿瘤细胞均可见明显液化和坏死,尤其以AdhTERT-Can治疗组最为明显,多呈囊性,心、肝、肾等重要脏器组织形态学观察未发现明显异常。9.体内实验还证实重组腺病毒AdhTERT-Can通过静脉注射对人卵巢癌移植瘤生长的抑制作用为持续性,直到注射后30天处死时,肿瘤仍然处于抑制状态。结论1.成功地构建了hTERT基因核心启动子调控canstatin基因重组腺病毒AdhTERT-Can。2.构建的重组腺病毒AdhTERT-Can能够感染卵巢上皮性癌细胞,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢上皮性癌移植瘤提供了一个良好的载体。3.体外实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can对卵巢上皮性癌细胞的生长周期无明显影响。4.体内实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用具有靶向性。5.重组腺病毒AdhTERT-Can能够通过抑制肿瘤的血管生成而抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长。6.canstatin基因抑制卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能是:诱导肿瘤组织高表达凋亡效应因子caspase-3,增加卵巢肿瘤细胞的凋亡;降低Flk-1的表达,抑制肿瘤的血管生成。7.重组腺病毒AdhTERT-Can在治疗卵巢上皮性癌移植瘤的同时,对心、肝、肾等重要脏器组织无明显影响。本研究创新点:1首次应用分子克隆技术将canstatin基因构建于hTERT启动子下游,使canstatin的治疗作用受hTERT启动子的调控,并成功地构建了hTERT启动子调控的canstatin基因重组腺病毒载体AdhTERT-Can。2体内实验证实重组腺病毒AdhTERT-Can不但能明显抑制卵巢上皮性癌移植瘤的生长,而且对卵巢上皮性癌移植瘤的抑制作用具有靶向性。3发现了canstatin基因抑制卵巢上皮性癌移植瘤生长的作用机制可能与凋亡效应因子caspase-3和Flk-1的异常表达有关。

论文目录

• 论文 hTERT基因启动子调控腺病毒介导Canstatin基因治疗卵巢上皮性癌的实验研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子canstatin基因重组腺病毒载体的构建
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 重组腺病毒AdhTERT-Can体外感染卵巢上皮性癌细胞株HO8910PM实验及其体内抑瘤实验
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论及创新点
• 综述 血管生成抑制因子Canstatin与肿瘤的关系及相关性研究进展
• 参考文献
• 英文缩略词
• 附录1 攻读博士学位期间获得的基金项目及发表的论文
• 附录2 主要载体图谱
• 致谢