一株青霉菌的分离鉴定及次级代谢成分研究

论文摘要

瑞香狼毒植物根有剧毒,为了研究这一特殊生态环境下的微生物种类及其产生的次级代谢产物,筛选出具生物活性的成分,从而为研究创制新药提供先导化合物,本实验做了如下主要工作:从陕西太白县的秦岭山上瑞香狼毒（Stellera Chamaejasme L.）根际土壤中采用平板稀释涂布法分离出一株高抑菌活性的真菌,形态学特征、ITS序列分析及与马尔尼菲青霉菌的比较分析表明,该菌为疣孢青霉菌YL-52（Penicillium verruculosum YL-52）。利用正交试验从温度、pH、振荡频率、接种量几个方面对该菌的发酵培养条件进行了优化,并对该菌的发酵液及各萃取相进行抑菌试验。具有活性的石油醚相利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对挥发油化学成分进行分析研究。乙酸乙酯相利用TLC法系统预试,并利用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、重结晶等手段分离纯化化合物。结果表明:发酵最佳优化条件为温度25℃、培养液pH 6.5、摇床振荡频率150 r/min、接种量为2个菌饼;抑菌试验表明发酵液对11种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用,其中对苹果干腐,苹果腐烂,番茄早疫病菌的抑制率达到80%以上;各萃取相抑菌活性为乙酸乙酯相﹥石油醚相﹥正丁醇相;TLC法系统预试表明其主要成分为挥发油、生物碱类、黄酮类、萜类、甾体及其苷类、酚性成分、内酯及香豆素、有机酸类;分离纯化到2个新化合物,MS, UV, IR, 1H NMR, 13C NMR, HMBC, HSQC波谱分析鉴定为8-羟基-3-（4-羟基戊烷基）-3,4-二氢异香豆素（YLZ-1）,3,4-二羟基-7-亚异丙基氮杂环-3,5-二烯-2,8-二酮（YLZ-2）。以上研究结果为该菌的工业化扩大培养及生物农药利用提供了一定的理论依据,并对分离到的化合物的研究应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 青霉菌属化学成分及其活性研究概况
• 1.2.1 生物碱类（alkloids）
• 1.2.2 Funicone 类化合物
• 1.2.3 Vermistatin 类
• 1.2.4 蒽醌类化合物（Anthraquinones）
• 1.2.5 酶类及菌素类
• 1.2.6 毒素类
• 1.2.7 其它类
• 1.3 疣孢青霉菌（PENICILLIUM VERRUCULOSUM）的化学成分及其生物活性研究进展
• 1.4 论文选题的依据
• 第二章 实验内容与方法
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.1.1 试验菌种及培养基
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 瑞香狼毒根际土中菌的筛选，纯化及鉴定
• 2.2.1 瑞香狼毒根际土中菌的筛选及分离纯化
• 2.2.2 菌的鉴定--插片法
• 2.2.3 菌的分子生物学鉴定--内转录间隔序列（ITS 法）
• 2.2.4 菌的平板鉴定
• 2.3 菌的发酵液及其萃取物抗菌活性测定
• 2.4 乙酸乙酯相的薄层层析系统预试
• 2.5 菌的发酵条件优化试验--单因素试验
• 2.5.1 不同温度下青霉菌的培养
• 2.5.2 不同pH 值下青霉菌的培养
• 2.5.3 不同频率下青霉菌的培养
• 2.5.4 不同接种量下培养
• 2.5.5 正交试验
• 2.6 疣孢青霉菌化学成分的提取与分离
• 2.6.1 提取
• 2.6.2 石油醚部分的气质联用色谱分析
• 2.6.3 乙酸乙酯部分的分离
• 2.7 化合物的结构解析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 瑞香狼毒根际土中菌的筛选，分离纯化及鉴定结果
• 3.1.1 菌的筛选及分离纯化结果
• 3.1.2 显微镜检测结果
• 3.1.3 分子生物学鉴定结果
• 3.1.4 平板鉴定培养结果
• 3.2 发酵液及萃取物抑菌活性结果
• 3.3 乙酸乙酯相的薄层层析系统预试结果
• 3.4 单因素试验结果分析
• 3.4.1 温度对青霉菌生长的影响
• 3.4.2 pH 对青霉菌生长的影响
• 3.4.3 摇床振荡频率对菌体生长的影响
• 3.4.4 接种量对菌体生长的影响
• 3.4.5 正交试验
• 3.5 疣孢青霉菌化学成分的分离鉴定结果
• 3.5.1 石油醚部分挥发油化学成分分析结果
• 3.5.2 乙酸乙酯相化合物的结构解析与鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 菌的鉴定
• 4.2 抑菌活性
• 4.3 TLC 法系统预试
• 4.4 次级代谢成分
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介