新生大鼠卵母细胞凋亡信号通路调控的实验研究

论文摘要

目的:研究FOXO3a（forkhead box group O）转录因子是否参与调控哺乳动物卵巢中裸露卵母细胞和原始卵泡内卵母细胞的凋亡及其调控通路。方法:（1）体外分离培养新生两天大鼠卵母细胞巢和原始卵泡内的卵母细胞。（2）实验分组和药物处理细胞方法:干细胞因子（Stem cell factor, SCF）和磷脂酰肌醇- 3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）抑制剂LY 294002作用细胞的终浓度分别为150ng/L和25μM。实验分为三组:未经处理的细胞作为对照组（SCF-）,SCF处理细胞组（SCF+）和SCF联合LY 294002处理细胞组（SCF+LY 294002）。为研究SCF对AKT、FOXO3a磷酸化的影响及其调控通路,SCF处理细胞组:SCF作用于细胞5 min;SCF联合LY 294002处理细胞组:LY 294002作用于细胞1 h后再加入SCF作用5 min。为研究SCF对卵母细胞凋亡和Bim、Bcl-2、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1表达的影响及其调控通路,SCF处理细胞组:SCF作用于细胞24 h;SCF联合LY 294002处理细胞组:SCF与LY 294002同时加入细胞培养基,共同作用24 h。（3）凋亡染色（TUNEL）观察卵母细胞凋亡状况。阳性结果判断:被染成棕黄色的为阳性细胞。凋亡率的计算方法:在400倍视野下,每张玻片上选取至少三个视野共100个细胞计数阳性卵母细胞占所有卵母细胞的百分比。（4）RT-PCR、Western blot检测观察FOXO3a及其下游靶分子与卵母细胞凋亡的关系。（5）免疫细胞化学检测:细胞分别与一抗FOXO3a、BIM、BAD、BAX、BCL-2、MnSOD或p27KIP1 （抗体1:25或1:100稀释）及对应的二抗孵育;3,3’二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）显色。细胞阳性率的计算方法:在400倍视野下,每张玻片上选取至少三个视野共100个细胞计数,得出阳性卵母细胞占所有卵母细胞的百分比。（6）采用SPSS 13. 0软件包进行统计学分析,数据以均数±标准差（?x±s）表示,组间比较均作单向方差分析,P <0.05有统计学差异,所有实验至少重复三次。结果:（1）SCF抑制卵母细胞凋亡;而LY 294002可完全阻断上述效果。（2）SCF不影响卵母细胞AKT、FOXO3a总蛋白表达水平,但可使其磷酸化水平增加;磷酸化的AKT活性增强,而磷酸化的FOXO3a活性下降。（3）SCF可使Bim、Bax、Bad和p27kip1表达下调,此作用同样可被LY 294002逆转。（4）SCF可使MnSOD表达上调,LY 294002可阻断该效果。（5）SCF不影响Bcl-2的表达。结论:（1）FOXO3a通过SCF-PI3K/AKT信号通路参与对新生大鼠卵母细凋亡和原始卵泡形成的调控。（2）Bim、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1可能作为FOXO3a的下游靶分子参与以上调控过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表文章
• 综述