部分杂交灿稻亲本DNA甲基化多态性与遗传稳定性的初步研究

论文摘要

自孟德尔时代起,DNA序列差异所形成的遗传变异被广泛研究并应用于育种。非DNA序列变异,如DNA甲基化、组蛋白修饰等亦可改变生物性状,包括重要农艺性状如株高、花期、抗性、产量等,并可稳定遗传。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,存在于许多高等动植物中,在基因的表达调控、细胞分化、基因组印记以及系统发育中起着重要的调控作用。然而,已有研究多关注于品种遗传改良,亲本间DNA甲基化多态性、遗传稳定性与生物学功能等基本科学问题还不明确。在本实验中,选取62份水稻样品,包括恢复系和保持系亲本20份(分两个地域种植收种,共40份样品),不育系1份,杂种1份及其分离群体20份,采用改良AFLP方法(MSAP),分析甲基化修饰在亲本间的多态性、在自交后代中的遗传稳定性,同时分析环境和细胞质对核基因组DNA甲基化的影响。旨在为DNA甲基化修饰应用于杂交稻育种奠定理论依据,从DNA甲基化表观遗传学角度为育种选择开拓新思路。结果如下：一、杂交稻亲本的甲基化多态性。海南收获的20个亲本样品用46对引物检测出1842个甲基化位点,数据显示亲本间甲基化多态性位点达43.38%,单态性位点达56.62%,表明本实验选择的水稻材料甲基化多态性位点丰富,具有很好的代表性；同时对甲基化位点进行聚类分析,获得的聚类图谱能直观的显示出亲本样品之间的甲基化遗传距离,并与系谱分析能很好的吻合。二、甲基化位点的遗传稳定性及环境对甲基化类型的影响。用4对引物对武汉与海南收获的40个样品检测出148个甲基化位点,分析表明亲本甲基化在武汉与海南间的不变类型达77.6%,在两地间的变化类型为22.4%,显示亲本自交后代甲基化位点大部分是可稳定遗传的,但环境差异对亲本甲基化类型具有较大影响。与武汉样品相比,海南样品的甲基化程度下降条带多于上升条带,说明环境差异对品种的甲基化类型有一定影响；环境变化引起了甲基化修饰的改变,进而发生植株性状的改变。三、亲本与杂交后代甲基化多态性分析。用6对引物对杂交稻亲本与子一代、子二代共23个样品检测出257个甲基化位点,数据分析表明亲本与子一代之间甲基化单态性位点占多数,子一代与子二代之间甲基化位点也类似。选择亲本间有差异的位点来分析其在后代间的遗传性,结果表明亲本的特异性位点可以遗传给子一代及其后代,但仍需进一步实验来验证甲基化位点的遗传性。四、细胞质对核基因组DNA甲基化类型的影响。选取保持系金科1B与不育系金科1A 2个样品,用27对引物检测出884个甲基化位点,分析表明二者存在差异的甲基化类型仅占类型总数的8.03%,说明细胞质差异对甲基化类型能够产生一定的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1. 表观遗传学
• 1.1 表观遗传学的基本定义
• 1.2 表观遗传学的发展
• 1.3 表观遗传学的研究内容
• 1.4 表观遗传学的分子机制
• 1.4.1 DNA甲基化
• 1.4.2 组蛋白修饰
• 1.4.3 染色质重塑
• 1.4.4 非编码RNA调控
• 1.4.4.1 长链非编码RNA
• 1.4.4.2 短链非编码RNA
• 1.4.5 基因组印记
• 1.5 表观遗传学的应用前景
• 2. DNA甲基化
• 2.1 DNA甲基化的机制
• 2.2 DNA甲基化在基因组内的分布及CpG岛
• 2.3 植物中5-甲基胞嘧啶的含量及分布
• 2.4 DNA甲基化的机制
• 2.5 植物中催化甲基化的酶
• 2.6 DNA去甲基化的方式
• 2.7 MBD蛋白与DNA甲基化识别
• 2.7.1 动物中的MBD蛋白
• 2.7.2 植物中的MBD蛋白
• 2.8 DNA甲基化的生物学功能
• 2.8.1 DNA甲基化维持植物正常生长发育
• 2.8.2 DNA甲基化与转基因植物的基因沉默有关
• 2.8.3 DNA甲基化与基因组防御
• 2.8.4 DNA甲基化与植物的开花有关
• 2.8.5 DNA甲基化可调节植物基因的表达
• 2.8.6 DNA甲基化调节植物转座元件的表观遗传
• 2.8.7 DNA甲基化与植物的杂种优势
• 3. DNA甲基化的研究方法
• 4. 立题依据
• 第二部分 材料与方法
• 1. 材料、试剂和仪器
• 1.1 水稻材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2. 试验方法
• 2.1 提取DNA的样品准备
• 2.2 DNA提取、定量与纯度测定
• 2.3 DNA甲基化分析
• 2.3.1 酶切、连接、预扩与选扩
• 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.3 银染
• 2.3.4 聚类分析
• 第三部分 结果与分析
• 1. 水稻种子发苗
• 2. 基因组DNA的提取与纯化
• 3. DNA酶切、预扩与选扩
• 4. MSAP分析
• 4.1 亲本间甲基化分析
• 4.1.1 甲基化水平分析
• 4.1.2 甲基化位点多态性分析
• 4.1.3 亲本甲基化位点聚类分析
• 4.2 亲本自交的遗传稳定性及环境对甲基化的影响
• 4.2.1 甲基化水平总体分析
• 4.2.2 甲基化类型遗传分析
• 4.2.3 甲基化类型的差异性分析
• 4.3 亲本与子代甲基化多态性的分析
• 4.3.1 甲基化水平分析
• 4.3.2 甲基化位点多态性分析
• 4.3.3 甲基化位点遗传性分析
• 4.4 细胞质对品种甲基化影响的分析
• 4.4.1 甲基化水平分析
• 4.4.2 甲基化类型变化分析
• 第四部分 讨论
• 1. 亲本及其杂交后代的甲基化多态性
• 2. 自交亲本的遗传稳定性及环境对甲基化的影响
• 3. 胞质差异对品种甲基化的影响
• 4. 本实验的不足与解决方案
• 4.1 实验方法
• 4.2 实验过程的不足及改进方法
• 4.2.1 阳性对照的设置
• 4.2.2 拖尾原因分析
• 4.2.3 优化体系
• 5. 实验展望
• 第五部分 参考文献
• 附表
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录