猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的实验研究

论文摘要

目的:探讨猪骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）自发分化和5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞的潜能,以及体外向心肌细胞分化的规律性。方法:抽取猪髂骨骨髓,密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养法筛选和培养MSCs,选取第9,10,11,12,15和20代MSCs,研究其向心肌样细胞自发分化潜能和5-氮胞苷诱导后4周能否分化为心肌细胞,并探索猪MSCs体外向心肌细胞分化的规律性。各代MSCs采用连续显微镜下观察、流式细胞仪、免疫细胞化学染色法、Real Time-PCR、透射电镜检测相关指标。结果:体外自然培养条件下,P9,P11,P12,P15,P20和大部分P10 MSCs形态一致,呈梭形成纤维细胞样形态,但部分P10细胞多核、胞浆延长,转变为肌管样形态。5-氮胞苷诱导1周后,部分P9,P11,P12,P15和P20MSCs表现为较长的胞浆形态和多核化,4周后更多细胞相互连接形成不规则的管样结构,而P10MSCs则形成相对规则的肌管样结构。流式法显示,P10MSCs的G0/G1期比例显著增多（88.00±3.90）%,P10与P9相比有显著性差异（P＜0.0001）,出现细胞生长停滞。贴壁细胞CD90、CD29阳性,而CD34、CD45阴性,说明贴壁细胞为MSCs。免疫细胞化学染色显示,自然培养和诱导4周后各代MSCs均表达心肌特异性结构蛋白Cx43和α-sarcomeric actin,而诱导后P10MSCs分化率与其他各代相比有显著性差异（P=0.011）。Real time-PCR结果表明,自然培养和诱导4周后的各代MSCs均有心肌特异性转录因子GATA4和结构基因MLC、α-SKA、Cx43、cTNI基因表达,而P10MSCs自然培养和诱导后4周,各基因的表达丰度均高于其他代在相同条件下的分化细胞,而α-SKA诱导后增高显著（P＜0.0001）,而P20MSCs表达的基因减少。透射电镜显示在自然培养状态下和诱导后4周,P9,P10,P11,P12,P15 MSCs均有较多不规则细肌丝,而P10MSCs经诱导后出现较多不规则排列粗肌丝,P20MSCs肌丝减少。结论:1.猪骨髓MSCs在体外自然培养条件下,各代形态、增殖能力和分化潜能是不均一的,传代次数的增加MSCs增殖逐渐变慢、部分细胞自发分化为心肌样细胞。2.MSCs于第10代出现细胞生长停滞,但并没有丧失多向分化潜能。3,在体外长期培养过程中,MSCs出现转化能力。4.5-氮胞苷可诱导MSCs分化为心肌样细胞,P10MSCs分化更具有成熟心肌细胞的特异性表型。4.结合本实验研究组前期的结果,推测P10可能是猪MSCs体外分化为心肌细胞过程中的拐点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 图表
• 综述
• 参考文献
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• 致谢