水稻OsSIZ1和OsAPX2基因的克隆和功能分析

论文摘要

本论文的研究内容主要包括两个部分:1)水稻T-DNA插入突变体siz1的分析和OsSIZ1基因的功能研究;2)水稻抗坏血酸过氧化物酶OsAPX2的克隆和功能分析。水稻是世界上重要的粮食作物之一,又是研究单子叶植物和禾本科植物的模式植物。水稻基因组测序工作圆满结束后,研究的主要任务就是解读基因组。突变体尤其是标签突变体无疑是研究基因功能的好材料,目前通过世界上很多国家科学家的努力已经建成了有相当规模的水稻突变体库,充分利用这些突变体资源来挖掘和鉴定基因的功能是当前很多研究人员在从事的工作,我们实验室也在这方面做了一些工作,并得到了一些有意义的结果。在对本实验室创制的水稻增强子捕获突变体库研究的过程中,我们从中选取了突变表型和T-DNA标签共分离的两个突变体进行基因功能的研究,主要研究内容和结果如下:1.水稻突变体siz1在MS培养基上生长一周后发现突变体的侧根与对照日本晴相比侧根稠密,该表型与T-DNA插入共分离,侧翼序列的分析表明T-DNA A正向插入在水稻第5染色体上的基因OSJNBb0079L11.3的第三内含子,与拟南芥的SUMO E3连接酶AtSIZ1在核苷酸序列的相似性达51.63%。Southern blot结果表明突变体中仅有一个拷贝的T-DNA插入,且无Tos17新的转座位点出现。对杂合突变植株后代的GUS染色结果表明该基因符合孟德尔规律,说明该基因为单基因。OsSIZ1基因的启动子驱动GUS基因在根、茎、叶、花和花粉等组织中表达,在花和根中的染色较其它组织更深,说明该基因在花和根中强烈表达。35S启动子驱动下的OsSIZ1和GFP融合表达载体的转基因烟草幼苗在激光共聚焦显微镜下观察,根细胞的细胞核和细胞外周发出强烈的绿色荧光。此外,我们的研究发现与日本晴相比,该突变体幼苗的地上部生长素含量低于日本晴,而根中生长素含量高于日本晴,外源生长激素IAA对突变体的主根和冠根有明显抑制作用。从野生型植株中获得该基因的全长cDNA发现有两种转录本,将两种转录本分别构建功能互补载体导入突变体中,将T0代转基因植株的后代T1种子用来鉴定根系表型恢复情况,发现在带有较长的转录本的转基因株系中有一个株系的根系发生表型分离,既有野生型也有突变型,这一结果与预期表型一致,说明通过引入野生型基因可以恢复突变表型,功能互补实验成功。同时为了比较该基因与拟南芥中的同源基因的差异,我们还把OsSIZ1基因导入拟南芥同源突变体siz1中,OsSIZ1基因的引入可以使植株矮小、长势弱的突变体的表型恢复到接近野生型植株,拟南芥功能互补实验结果初步证明了OsSIZ1基因与拟南芥中的同源基因AtSIZ1基因在功能上有相似之处。本研究结果为深入研究SUMO化在水稻生长发育过程中扮演的角色提供了有用的线索,同时也为研究单子叶与双子叶植物中SUMO化的异同提供了参考。2.水稻矮杆不育突变体apx2中T-DNA插在OsAPX2的第四内含子,OsAPX2基因的表达完全被抑制后,导致水稻花药生长畸形,花粉活力严重下降,植株不能结实。apx2突变体的侧翼序列扩增也仅扩增到一个T-DNA插入而没有Tos17的新位点,矮杆不育性状与T-DNA插入共分离,这些结果意味着该基因的突变可能是导致突变表型的原因,因此我们进行了功能互补实验。将OsAPX2基因导入纯合突变体后,T0代再生植株可以结实,植株高度恢复到接近野生型水稻的高度。OsAPX2基因的启动子驱动GUS基因在根、叶、茎节、叶舌、花和花药表达,说明抗坏血酸过氧化物酶APX2在水稻中广泛存在。OsAPX2基因和GFP融合表达后在转基因烟草根细胞的细胞质和细胞外周发出可见绿色荧光。对突变体、互补转基因植株和过量表达植株叶片进行组织化学染色（DAB和NBT）,发现突变体中活性氧含量高于对照,而互补转基因植株中的活性氧含量与野生型一致,说明OsAPX2基因的突变导致水稻叶片活性氧含量升高,尤其是H2O2的含量升高。研究还发现植株体内过量表达OsAPX2并不能提高植物清除活性氧的能力,相反会造成胁迫,说明植物体内活性氧的产生与清除存在一个动态的、精妙的平衡,不容打破。研究结果表明OsAPX2确实在水稻中起到清除活性氧的作用,该基因的克隆为揭示抗坏血酸过氧化物酶与活性氧H2O2的清除之间的关系提供了更多直接的证据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 植物标签突变体简介
• 1.1 T-DNA 插入标签突变体
• 1.1.1 T-DNA 和 T-DNA 插入的效应
• 1.1.2 T-DNA 插入突变技术改进
• 1.2 转座子标签突变体
• 1.3 标签突变体的研究方法
• 1.3.1 突变体的筛选
• 1.3.2 插入位点侧翼序列的分离
• 1.4 标签突变体研究水稻基因功能已取得的成绩
• 1.5 本研究的目的和技术路线
• 1.5.1 本研究的目的
• 1.5.2 技术路线
• 第二部分 水稻 OSSIZ1 突变体的研究和基因功能的初步分析
• 第一章 文献综述
• 1.1 SUMO 修饰
• 1.1.1 SUMO 分子
• 1.1.2 SUMO 化循环及参与 SUMO 化循环的酶
• 1.2 SUMO 化的生物学功能
• 1.3 SUMO 化在植物生长发育中的作用
• 1.3.1 SUMO 化与植物对环境的响应
• 1.3.2 SUMO 化与植物对激素的响应
• 1.3.3 SUMO 化与开花时间的关系
• 1.3.4 SUMO 化与病菌的侵染和植物对病菌的防御的关系
• 1.4 泛素化和类泛素化与植物根的发育的关系
• 1.5 泛素或类泛素分子的转录后调控与植物磷饥饿响应
• 1.6 生长素与磷有效性的交互作用对侧根发育的调控机制
• 第二章 水稻多侧根突变体侧翼序列的扩增和生物信息学预测
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 PCR-Walking 扩增突变体中 T-DNA 和 Tos17 侧翼序列
• 2.1.2 T-DNA 插入与表型的共分离分析
• 2.1.3 被破坏基因 OsSIZ1 的蛋白结构分析
• 2.1.4 OsSIZ1 基因启动子区保守元件的预测
• 2.1.5 生物信息学预测 OsSIZ1 蛋白的亚细胞定位
• 2.1.6 生物信息学分析 OsSIZ1 在水稻中的表达
• 2.1.7 野生型和突变体中侧根数目的统计
• 2.1.8 Real–time PCR 检测 OsSIZ1 在日本晴和突变体植株中的表达
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 OsSIZ1 基因的结构分析
• 2.2.2 T-DNA 标签与表型共分离实验
• 2.2.3 OsSIZ1 基因的蛋白结构分析
• 2.2.4 OsSIZ1 基因启动子区保守元件的预测
• 2.2.5 OsSIZ1 基因蛋白核定位信号及跨膜域的预测
• 2.2.6 生物信息学分析 OsSIZ1 在水稻中的表达
• 2.2.7 野生型和突变体中侧根数目的比较
• 2.2.8 野生型和突变体中 OsSIZ1 基因的表达差异
• 2.3 讨论
• 第三章 水稻候选基因OSSIZ1 的克隆、功能互补表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RT-PCR 扩增目的基因
• 3.2.2 功能互补载体的构建
• 3.3 讨论
• 第四章 农杆菌介导的水稻转化与转基因植株的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 水稻转基因植株的获得
• 0 代转基因植株的 PCR 检测和田间表型观察'>4.2.2 T₀ 代转基因植株的 PCR 检测和田间表型观察
• 1 代转基因互补植株根系发育状态比较'>4.2.3 野生型日本晴与T₁代转基因互补植株根系发育状态比较
• 4.3 讨论
• 第五章 水稻 OSSIZ1 基因在拟南芥突变体中的功能鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 T-DNA 插入突变体的鉴定
• 5.2.2 拟南芥功能互补载体的构建
• 5.2.3 转基因植株的分子检测和表型鉴定
• 5.3 讨论
• 第六章 水稻 OSSIZ1 基因功能的初步分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料和试剂
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 GUS 组织表达模式
• 6.2.2 烟草转基因植株中OsSIZ1-GFP 融合基因的蛋白表达定位
• 6.2.3 Real-time PCR 检测基因在不同器官的表达
• 6.2.4 OsSIZ1 基因遗传规律分析
• 6.2.5 生长素含量的测定
• 6.2.6 突变体对生长素抑制剂 NPA 表现出不同的抗性
• 6.2.7 不同浓度 IAA 对水稻根系生长的影响
• 6.3 讨论
• 第七章 结论
• 第三部分 水稻矮杆不育基因 OSAPX2 的克隆和功能分析
• 第一章 文献综述
• 1.1 活性氧及其在植物体中的作用
• 1.2 细胞中活性氧产生的部位
• 1.2.1 过氧化酶体
• 1.2.2 叶绿体
• 1.2.3 线粒体
• 1.2.4 其他细胞器
• 1.3 植物体清除活性氧的机制
• 1.4 抗坏血酸过氧化物酶在清除活性氧过程中的作用
• 1.5 抗坏血酸过氧化物酶的分布和亚细胞定位
• 1.6 抗坏血酸过氧化物酶（APX）的研究进展
• 1.7 抗坏血酸过氧化物酶（APX）的转基因研究
• 1.8 活性氧与植物发育及育性的关系
• 1.9 研究对象和技术路线
• 第二章 水稻矮杆不育突变体的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 T-DNA 和 Tos17 侧翼序列的分析
• 2.2.2 矮杆不育性状与 T-DNA 共分离分析
• 2.2.3 RT-PCR 检测 OsAPX2 基因的表达
• 2.3 讨论
• 第三章 水稻抗坏血酸过氧化物酶 OSAPX2 的克隆及功能分析..
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 RT-PCR 扩增OsAPX2 基因全长cDNA 构建功能互补表达载体.
• 3.2.2 农杆菌侵染转化纯合突变体apx2
• 3.2.3 转基因植株的 PCR 检测和表型鉴定
• 3.3 讨论
• 第四章 水稻 OSAPX2 基因的功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 OsAPX2 基因启动子表达模式的分析
• 4.2.2 烟草转基因植株中OsAPX2-GFP 融合基因的蛋白表达定位
• 4.2.3 水稻植株花期生殖器官的形态学观察
• 4.2.4 花粉活力的测定
• 4.2.5 叶片内 ROS 含量的组织化学染色
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 本研究的创新性
• 致谢
• 作者简历