论文题目: 过量表达细菌的FolC和FolP基因对提高拟南芥叶酸含量的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 梁业红
导师: 范云六
关键词: 拟南芥,叶酸,生物合成,代谢工程
文献来源: 中国农业科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 作为供给人体叶酸需求的主要来源之一,植物中的主要作物如水稻、小麦和玉米的叶酸含量很低。对植物叶酸合成途径调控机理的研究,目前仅对GTP环化脱羧酶（GCHI）有较深入的研究。本文拟对植物叶酸生物合成途径中的另外2个酶即二氢叶酸合成酶/多谷氨酰胺叶酸合成酶（DHFS/FPGS）以及二氢喋呤合成酶（DHPS）进行研究,探讨它们在植物（拟南芥）叶酸生物合成中的作用。在植物中DHFS和FPGS分别由不同的基因编码,而在E.coli中则由FolC基因同时编码;DHPS在E.coli中由FolP基因编码,在植物中则由类似的基因编码。将来源于E.coli的FolC和FolP基因分别与酵母CoxⅣ基因的线粒体定位序列连接,并由CaMV 35S启动子驱动。取得了以下主要研究结果: 1.系统地分析了来源于E.coli的FolC基因的作用:（1） Northern blot和Taqman RT-PCR分析表明,来源于E.coli的FolC基因在拟南芥植株中得到了表达。（2） 对FolC转基因纯系C4-3-3、C11-6-8和C12-13-1的幼苗植株和幼嫩叶片的叶酸含量分析表明,这3个纯系幼苗植株的叶酸含量分别为2.23、2.46和2.51 nmol/g鲜重,而对照为1.77 nmol/g鲜重:这3个纯系其幼嫩叶片的叶酸含量分别是5.07、5.54和4.31 nmol/g鲜重,对照为3.09 nmol/g鲜重。因此无论是幼苗植株还是幼嫩叶片,转基因纯系的叶酸含量均显著高于对照。（3） mRNA表达高的纯系C11-6-8,其叶酸含量也高,而mRNA表达较C11-6-8低的纯系C4-3-3和C12-13-1,则其叶酸含量也相应低,因此FolC转基因纯系的叶酸含量与FolC基因的mRNA表达量呈正相关。（4） 对转基因纯系其内源DHFS/FPGS编码基因的mRNA表达的定量分析结果表明,外源FolC基因在幼嫩叶片中的过量表达,并没有促进内源DHFS/FPGS编码基因的表达。 因此外源FolC基因在拟南芥植株中的过量表达,提高了植株的叶酸含量,而且转基因植株叶酸含量的提高是由于外源FolC基因而非内源DHFS/FPGS编码基因作用的结果。 2.分析了拟南芥野生型植株内源DHFS/FPGS编码基因的表达以及植株不同发育时期叶片的叶酸含量。Taqman RT-PCR分析表明:内源不同的DHFS/FPGS编码基因其mRNA表达水平不同,幼嫩叶片中DHFS和FPGS-3的表达量最高;此外,DHFS和FPGS-1、FPGS-2、FPGS-3的总表达量在幼嫩叶片中最高,具有组织特异性。叶酸的测定结果表明,不同发育时期叶片的叶酸含量不同。结合内源DHFS/FPGS编码基因的表达分析以及对叶酸含量的分析,结果显示:野生型植株的叶酸含量与内源DHFS/FPGS编码基因的mRNA表达量呈正相关。 3.FolC转基因植株比野生型植株开花明显提前,但对植株的生长发育没有负面影响,相反FolC单拷贝纯系C11-6-1和C12-13-1的单株结荚数和单株干重还明显高于对照植株。 4.Northern blot分析表明,来源于E.coli的FolP基因在拟南芥植株中得到了表达。对FolP转基系株系的叶酸测定结果显示,独立株系P26、P45和P49的T3幼苗其叶酸含量分别是2.30、1.63和2.03 nmol/g鲜重,而野生型对照为1.32 nmol/g鲜重,转基因株系的叶酸含量均显著高于对照。 综上所述,本文首次研究了DHFS/FPGS和DHPS的编码基因对提高拟南芥叶酸合成的作
论文目录:
论文评阅人和答辩委员会
独创性声明
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
1.1 植物代谢工程研究进展
1.2 叶酸研究进展
1.2.1 叶酸的化学结构与生理功能
1.2.2 叶酸与人体健康
1.2.3 植物生物合成的天然叶酸
1.2.4 叶酸的添加、强化以及人工叶酸的副作用
1.2.5 植物叶酸的生物合成
1.2.6 叶酸的测定方法
1.2.7 酶活性及代谢中间化合物的测定
1.2.8 植物叶酸代谢工程研究进展
1.2.9 叶酸研究进展小结
1.2.10 DHFS、FPGS和DHPS的研究进展小结
1.2.11 本研究的立题依据、研究目的、意义和技术路线
第二章 材料与方法
2.1 基因的分离、载体的构建和农杆菌转化
2.1.1 菌株、载体、引物设计及实验试剂
2.1.2 E. coli基因及酵母CoXIV线粒体定位序列的分离
2.1.3 E. coli染色体DNA的提取
2.1.4 PCR扩增
2.1.5 E. coli热激感受态细胞的制备
2.1.6 酶连体系／质粒转化E. coli
2.1.7 PCR产物克隆到载体pPCR-Script
2.1.8 克隆到pFLAP10
2.1.9 克隆到pBBC10
2.1.10 pHFolC和pHFolP转化农杆菌AGLo及其检测
2.2 拟南芥的生长条件及取样
2.2.1 用于Northern blot分析的样品
2.2.2 用于分析叶酸含量的样品
2.3 拟南芥的转化
2.4 转基因植株的筛选
2.4.1 种子表面消毒
2.4.2 卡那霉素筛选T_1独立转化植株及纯系的筛选
2.4.3 T_2代植株卡那霉素抗性比例分析
2.4.4 转基因植株的PCR检测
2.5 Northern blot分析
2.5.1 拟南芥总RNA的提取
2.5.2 RNA电泳
2.5.3 RNA转膜
2.5.4 分子杂交
2.6 Taqman RT-PCR分析
2.7 叶酸含量分析
2.7.1 叶酸的提取
2.7.2 叶酸的酶解
2.7.3 指示菌的制备
2.7.4 叶酸标样的准备
2.7.5 叶酸含量的测定
2.8 植株的表型分析
第三章 植物表达载体的构建
3.1 FolC和FolP基因及线粒体定位序列的克隆与鉴定
3.2 双元表达载体pHFolC、pHFolP的构建及农杆菌转化
3.2.1 载体的构建
3.2.2 pHFolC和pHFolP转化根癌农杆菌
3.3 小结
第四章 转基因植株的筛选
4.1 转基因独立转化植株的筛选
4.1.1 FolC独立转化植株的获得
4.1.2 FolP独立转化植株的获得
4.2 卡那霉素抗性遗传分析
4.2.1 转FolC基因植株分析
4.2.2 转FolP基因植株分析
4.3 转基因纯系的筛选
4.3.1 获得4个独立的FolC转基因纯系
4.3.2 转FolP基因纯系的筛选
4.4 小结
第五章 转基因植株FolP基因表达检测及其叶酸含量测定
5.1 FolP转基因植株的Northern blot分析
5.2 FolP转基因植株叶酸含量的测定
5.3 小结
第六章 拟南芥野生植株内源DHFS／FPGS基因表达分析及叶酸含量测定
6.1 内源DHFS／FPGS基因的表达分析
6.1.1 不同基因的表达差异分析
6.1.2 不同组织DHFS及FPGS表达量比较
6.2 拟南芥野生型植株叶酸含量分析
6.3 小结
第七章 FolC转基因植株分析
7.1 FolC转基因植株的Northern blot分析
7.2 Taqman RT-PCR定量分析
7.2.1 FolC基因的表达量分析
7.2.2 FolC转基因植株内源DHFS／FPGS的表达分析
7.3 FolC转基因植株叶酸含量的测定
7.3.1 幼苗植株的叶酸含量分析
7.3.2 植株幼嫩叶片的叶酸含量
7.4 转基因植株的表型分析
7.5 小结
第八章 结论与讨论
研究创新点
参考文献
附录
致谢
作者简历
发布时间: 2005-09-05
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