论文摘要
前言Runx3（PEBP2αC/CBFA3/AML2）是新近发现的一种抑癌基因，属于runt结构域转录因子家族成员，参与对细胞生长和凋亡的调控。近年来，大量的研究表明Runx3与多种恶性肿瘤尤其是与胃癌的关系非常密切，因此有望成为胃癌诊断的特异性标志物和基因治疗的靶点。但目前国内外众多文献报道的胃癌Runx3基因甲基化阳性率差异较大，且其与Runx3表达并不完全平行。因此Runx3基因CpG岛不同位点甲基化对于该基因沉默的作用可能不同。目的研究人胃癌Runx3基因CpG岛甲基化的关键位点和演进。材料与方法1、材料26例人胃癌和相应的癌旁正常组织均来自中国医科大学附属盛京医院2006年2月至2006年12月手术切除并于-80℃保存的标本，其中男性16例，女性10例，年龄24-80岁，平均58.7岁；分化情况：低分化（未分化或低分化）17例，高分化（中分化或高分化）9例；国际抗癌联盟分期（UICC，1997）：Ⅰ期7例，Ⅱ期4例，Ⅲ期8例，Ⅳ期7例。2、甲基化特异性PCR（MSP）应用MSP法检测上述组织标本中Runx3基因CpG岛从5’区向转录起始点方向连续6个位点的甲基化状态，并计算所有位点甲基化的阳性率。3、Western blot应用western blot法检测上述组织标本中Runx3蛋白的表达，取Runx3蛋白的灰度值/Tubulin的灰度值代表Runx3蛋白的相对表达水平进行统计学分析。4、统计学分析实验结果经SPSS 14.0统计软件的x2检验（或Fisher确切概率法）和t检验处理，P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1、甲基化特异性PCR（MSP）结果根据MSP的结果计算出上述连续6个位点甲基化的阳性率：结果随着向转录起始点方向的演进，各位点甲基化的阳性率逐渐降低，胃癌组：第1位点为92.31％（24/26）、第2位点为88.46％（23/26）、第3位点为65.38％（17/26）、第4位点为61.54％（16/26）、第5位点为46.15％（12/26）、第6位点为46.15％（12/26），癌旁组：第1位点为96.15％（25/26）、第2位点为84.62％（22/26）、第3位点为50％（13/26）、第4位点为46.15％（12/26）、第5位点为19.23％（5/26）、第6位点为11.54％（3/26），胃癌组和癌旁组从第3位点开始出现差异，至第5、6位点差异显著（p<0.05）；按照胃癌分化程度分组，低分化组与高分化组在第3-6位点差异显著（p<0.05）。2、Westem blot结果Runx3蛋白的相对表达水平，胃癌组为：0.499±0.106，癌旁组为：0.721±0.080，低分化组为：0.437±0.053，高分化组为：0.617±0.073，胃癌组与癌旁组以及低分化组与高分化组的Runx3蛋白表达水平存在显著差异（p<0.01）。讨论Runx3是新近发现的一种抑癌基因，研究表明启动子CpG岛高甲基化是该基因表达沉默的主要方式之一。在本研究中，我们通过MSP法检测了26例胃癌和相应的癌旁正常组织标本Runx3基因启动子CpG岛连续6个位点的甲基化状态，并计算各位点甲基化的阳性率。由于两组的第1和第2位点的阳性率无显著差异，第3-6位点存在差异（第5、6位点差异显著），因此以往实验研究的位点很可能位于该区间，在本研究中其甲基化阳性率为42.31-65.38％，与以往的报道相符。研究表明胃癌中Runx3蛋白常常表达下调。在本研究中，我们通过westem blot法检测了26例胃癌及相应的癌旁正常组织Runx3蛋白的表达，结果表明胃癌组Runx3蛋白表达明显低于癌旁组，且Runx3蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关，亦与报道相符。目前国内外众多文献报道的人胃癌Runx3基因的甲基化阳性率差异较大，且与Runx3表达并不完全平行，提示Runx3基因CpG岛不同位点甲基化的结局不同，可能存在其甲基化能引起该基因表达沉默的关键位点。本研究结果表明胃癌组与癌旁组以及低分化胃癌组和高分化胃癌组的Runx3蛋白表达存在显著差异（p<0.01），同时上述情况下的甲基化阳性率存在显著差异（胃癌组和癌旁组在第5、6位点差异显著，低分化胃癌组和高分化胃癌组在第3-6位点差异显著，p<0.05），而按性别、年龄和临床分期分组，Runx3蛋白表达无显著差异，该情况下各位点的甲基化阳性率亦无显著差异。上述结果提示转录起始点部位（即本研究中的第5、6位点）的甲基化很可能引起Runx3蛋白表达下调，因此该部位可能为Runx3基因启动子CpG岛甲基化的关键位点。同时本研究结果表明，从5’区向转录起始点方向连续6个位点甲基化的阳性率逐渐降低，提示甲基化最初可能发生在Runx3基因CpG岛的5’端，并逐渐向转录起始点方向演进；进一步统计分析表明所有位点的甲基化阳性率与性别、年龄和临床分期无关，而第3-6位点的阳性率与肿瘤的分化程度有关，提示甲基化的演进可能与肿瘤的分化程度有关，而与性别、年龄和临床分期无关。结论人胃癌Runx3基因启动子CpG岛的甲基化从5’区向转录起始点方向演进，甲基化的演进与肿瘤的分化程度有关，而与性别、年龄和临床分期无关；转录起始点部位可能为Runx3基因甲基化的关键位点。