甘蓝型油菜油质蛋白（Oleosin）cDNA的克隆和表达

论文摘要

油质蛋白（Oleosin）是一类特殊的贮藏蛋白,主要在油料植物种子中特异表达,以膜嵌入方式依附在油体表面,在油体发生和分解消失过程中起着重要生物学作用。本文以甘蓝型油菜种子中油质蛋白的cDNA为研究对象,对其进行克隆和表达,用以了解油质蛋白在甘蓝型油菜中时、空的表达以及与TAG积累的关系,同时为油质蛋白（Oleosin）在植物基因工程中利用提供分子生物学基础。 1.本文利用热CTAB-LiCl联用法从油菜种子中提取RNA,所得到的RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较高的纯度和完整性,并克服了油脂、多糖及次生代谢物质等的干扰。 2.RT-PCR法从种子中扩增Oleosin的cDNA片段和Perilipin、SREBP的cDNA片段。电泳结果表明:在植物种子中没有扩增到动物脂肪周边蛋白的cDNA片断,而动物中控制脂肪代谢过程中合成酶的转录因子有条带,说明动植物在脂肪合成上有相同的脂肪合成代谢调控。测序结果表明:甘蓝型和白菜型油菜种子中的Oleosin的cDNA序列分别是275bp、281bp,同源性为91%。通过5’RACE对油质蛋白的cDNA进行全长扩增,并进行Blast比对:484bp片段与拟南芥4号染色体A6（1989bp）的beta-1,3 glucanase homologue同源性高。 3.利用扩增油质蛋白的cDNA片段作探针,对不同时期和含油量不同油菜种子中的mRNA进行Northern blotting,结果表明不同含油量的种子中,mRNA在表达上的差异不明显,说明与含油量即TAG的积累没有直接的关系。 4.重新设计一个单引物与5’RACE的巢式引物扩增甘蓝型与白菜型种子中油质蛋白读码框的cDNA,与pMD18-T载体连接克隆、测序,甘蓝型与白菜型种子中读码框的cDNA同源性为99%,连接上面扩增的白菜型种子中的油质蛋白的cDNA片段,对白菜型的Oleosin-like-protein接近全长的cDNA进行基因注册。 5.构建油质蛋白读码框cDNA与pTYB2的表达载体,诱导融合蛋白在ER2566中原核表达,迎过几丁质预装柱纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测鉴定,表明约93KDa融合蛋白在ER2566中表达,获得纯化的蛋白接近27KDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 种子中油体的概述
• 1.2 油质蛋白的发现
• 1.3 油质蛋白的基因及其表达调控
• 1.4 油质蛋白的基本结构
• 1.5 油质蛋白的生物学功能
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 种子中的RNA提取
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA的含量
• 3.2 RNA的电泳结果
• 4 讨论
• 第三章 Oleosin和Perilipin、SREBP基因片断的扩增
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 3 结果及分析
• 3.1 RT—PCR电泳结果与分析
• 3.2 Oleosin片断5'RACE的结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 不同时期和不同含油量种子中oleosin的表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 对Oleosin的读码框cDNA进行测序和基因注册
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 Oleosin的读码框的cDNA的测序结果与分析
• 3.2 注册基因片段
• 4 讨论
• 第六章 Oleosin的读码框的cDNA原核表达和蛋白质纯化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR产物及酶切产物的电泳结果
• 3.2 SDS—PAGE电泳结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录