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产黄青霉异青霉素N酰基转移酶基因的克隆表达与定向进化

2020-12-11阅读(646)

产黄青霉异青霉素N酰基转移酶基因的克隆表达与定向进化

论文摘要

青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。产黄青霉Penicillium chrysogenum是青霉素工业生产菌株,菌种改良是提高产量的重要手段之一,是抗生素工业的重要的研究课题。现代分子生物学技术,特别是代谢途径工程研究的进展,使得我们可以通过外源基因的导入,有目的地改造产黄青霉的代谢途径,从而突破产量瓶颈,甚至产生新的产物,实现菌种选育的理性化。产黄青霉以α-氨基已二酸、半胱氨酸和缬氨酸为起始,以苯乙酸做为侧链前体,经过ACV合成酶、异青霉素合成酶、异青霉素N乙酰转移酶和苯乙酰辅酶A连接酶的催化生成青霉素G。其中决定青霉素侧链类型的两种关键酶一个是苯乙酰辅酶A连接酶（PCL）,催化苯乙酸与CoA反应生成苯乙酰CoA;另一个是异青霉素N酰基转移酶（IAT）,催化苯乙酸CoA与6APA反应生成青霉素G。本文从产黄青霉Penicillium chrysogenum中克隆到penDE基因,并在E.coli BL21（DE3）中得到高效表达;进行了重组菌诱导条件的优化;通过易错PCR进行定向进化,最后选出一株突变菌株。主要结果如下:（1）本研究根据酶反应体系的pH变化,通过pH显色剂的颜色变化,指征反应的进行程度。本筛选模型采用96酶标板,上样量小,检测灵敏,最低显色浓度为1 mmol/L。这种方法可以高通量地检测酶活和定向进化突变酶的筛选。（2）本研究采用RT-PCR方法,从产黄青霉中克隆了β-内酰胺抗生素合成途径中的异青霉素N酰基转移酶（penDE）基因。基因测序结果表明基因片段大小为1074bp,与NCBI数据库中多个产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶（登录号分别为:XM002569066.1,AM920436.1,EF601124.1,DQ192518.1,M31454.1）的核苷酸和氨基酸序列100%同源。与构巢曲霉的苯乙酰CoA连接酶的的核苷酸序列同源性为83%（登录号分别为:XM002380606.1,XM001825397.1）。（3）构建了原核表达载体pET-penDE。优化了penDE在E.coli中的诱导条件,使其从无活性的40kDa包涵体形式存在蛋白,表达成为可溶性高、具有催化活性的融合蛋白。确立了最佳条件为:当OD600为1.0时添加终浓度为10mmol/L的乳糖诱导,培养温度为16℃;诱导出29kDa和16kDa（His-Tag 5 kDa）的特异性融合蛋白,并对其进行分离纯化,得到了有活性表达的纯化酶。（4）研究了酶底物的特异性,表明苯乙酸是酶的天然底物,而噻吩丙二酸及对羟基苯甘氨酸不是。（5）采用随机策略,经过易错PCR得到一个突变酶Trp120Arg,对替卡西林有微弱催化活性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 青霉素简介
  • 1.2 青霉素的研究和应用
  • 1.2.1 青霉素的由来
  • 1.2.2 青霉素的作用机制
  • 1.2.3 青霉素的不良反应
  • 1.2.4 青霉素的种类
  • 1.2.5 青霉素的合成过程中的几种关键酶
  • 1.3 国内外研发现状
  • 1.4 课题研究的意义与主要研究内容
  • 1.4.1 研究意义
  • 1.4.2 研究内容
  • 第2章 筛选模型的建立
  • 2.1 材料和仪器
  • 2.1.1 菌株及载体
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 主要仪器
  • 2.2 酶活检测方法及筛选模型的研究
  • 2.2.1 6APA 的检测
  • 2.2.2 筛选模型的建立
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 6APA 的检测
  • 2.3.2 固体培养基模型
  • 2.3.3 定性检测模型
  • 2.4 本章小结
  • 第3章 产黄青霉异青霉素N 酰基转移酶基因的克隆及表达
  • 3.1 材料和仪器
  • 3.1.1 菌株及载体
  • 3.1.2 培养基
  • 3.1.3 主要试剂
  • 3.1.4 主要仪器
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 产黄青霉总RNA 的提取
  • 3.2.2 RT-PCR 反应获得6APA 酰基转移酶基因（penDE）基因全长cDNA
  • 3.2.3 PCR 引物设计与目的基因的获得
  • 3.2.4 目的基因DNA 的纯化与回收
  • 3.2.5 克隆载体penDE-PEASY-T1 的构建及测序
  • 3.2.6 pET-penDE 表达载体的构建
  • 3.3 重组6APA 酰基转移酶基因在E.coli 中的诱导表达
  • 3.3.1 SDS-PAGE 电泳
  • 3.3.2 粗酶液制备
  • 3.4 结果与讨论
  • 3.4.1 产黄青霉（Penicillium chrysogenum）总RNA 的获得
  • 3.4.2 penDE 基因克隆
  • 3.4.3 克隆载体penDE-pEASY/T1 的构建与鉴定
  • 3.4.4 表达载体pET-penDE 的构建及鉴定
  • 3.4.5 质粒构建流程图
  • 3.4.6 IAT在E. coli 中的表达以及SDS-PAGE 分析
  • 3.4.7 诱导培养条件的优化
  • 3.5 本章小结
  • 第4章 异青霉素N 酰基转移酶的纯化与酶学性质
  • 4.1 材料与仪器
  • 4.1.1 菌株及试剂
  • 4.1.2 主要仪器
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 菌体的裂解
  • 4.2.2 蛋白质的分离纯化
  • 4.2.3 凝胶过滤法
  • 4.2.4 组氨酸标签蛋白的纯化
  • 4.3 纯化酶的制备
  • 4.3.1 酶纯化的预实验
  • 4.3.2 酶的纯化
  • 4.4 产黄青霉对不同侧链前体的利用情况研究
  • 4.5 纯化酶的底物特异性验证
  • 4.6 结果与讨论
  • 4.6.1 通过抑菌圈表征酶的目标性质酶活的大小
  • 4.6.2 SDS-PAGE 检测重组蛋白IAT
  • 4.6.3 纯化酶的酶活测定及底物特异性的验证
  • 4.7 本章小结
  • 第5章 异青霉素N 酰基转移酶的定向进化
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 菌株与质粒
  • 5.1.2 试剂
  • 5.1.3 仪器设备与耗材
  • 5.2 体外定向进化策略的选择
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 易错PCR 构建IAT 突变体库
  • 5.3.2 复筛反应体系
  • 5.4 结果与讨论
  • 5.4.1 易错PCR
  • 5.4.2 IAT 突变体库的构建
  • 5.4.3 复筛结果
  • 5.5 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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