论文摘要
自然转化、接合和转导是目前已知的三种经典的细菌基因水平转移途径,可以通过对供受体细胞间直接接触的依赖性以及DNase敏感性验证来对这三种过程进行区分。而在这三种细菌水平基因转移方式中,只有自然转化被认为是名副其实的细菌基因转移过程,它的进行涉及到细菌染色体上数十个基因的功能,而接合和转导则分别只与质粒和噬菌体相关。说明在微生物进化的历程中,转化很可能扮演着重要的角色。从研究历史看,自然转化长期以来一直主要被用作对细菌进行遗传分析和基因重组的实验手段。由于DNA易于人工提取,因此在传统上对转化的研究历来都是以受体为主体,很少考虑DNA的来源及给体细胞的作用。但在自然界中,胞外游离的DNA片段是有限的,受体细胞花费巨大的基因资源建立的复杂体系如果只是为了吸收细胞周围随机存在的游离DNA是难以令人想象的。对细菌自然转化过程而言,势必还存在其他形式的供体DNA来源。因此,对细菌在生长阶段向胞外“主动”释放DNA现象及DNA给体细胞功能的研究被认为是彻底揭示自然遗传转化过程生物学意义的关键。本实验室早期对枯草芽胞杆菌的研究发现,该菌可在不添加外源DNA的情况进行细胞间遗传重组,该过程对DNase敏感,因此曾被认为是自然转化的一种形式。本文在前期工作的基础上,对B. subtilis细胞间的该遗传重组过程进行了进一步深入分析。研究结果显示,B. subtilis细胞间遗传重组过程主要通过染色体DNA片段在供受体细胞间的转移而发生,该过程在B. subtilis中具有一定的普遍性。由于该过程对DNase敏感,类似于转化,所以我们首先对转化DNA的来源进行了探索,结果发现供体菌培养液上清中含有13kb DNA片段,因而推测该DNA片段可能为细胞间遗传重组过程中的供体DNA来源。经过进一步分析发现,该DNA片段是由存在于供体菌当中的缺陷性原噬菌体PBSX的活动而产生的。许多B. subtilis菌株中都含有PBSX,在正常情况下,PBSX的编码基因整合在宿主基因组上,该噬菌体颗粒可通过对宿主菌进行丝裂霉素C （MMC）诱导而大量产生。PBSX颗粒为头尾状,其头部包裹的并非自身编码基因,而是一段来自于宿主细胞染色体上,大小为13kb的随机DNA序列。该特性类似于可以介导水平基因转移过程的基因转移因子GTA。因此我们通过PBSX的过表达以及相关基因的敲除对PBSX和B. subtilis细胞间遗传重组过程的相关性进行了研究。研究结果显示,PBSX并不介导B. subtilis细胞间的遗传重组过程。Bsubtilis细胞间遗传重组过程的正常发生依赖于供受体细胞间的直接接触,该特点和接合过程非常类似。与此同时,B. subtilis细胞间遗传重组过程的高效发生依赖于供体菌的活菌数,而且细胞间遗传重组的频率也远高于相同条件下游离DNA和受体细胞间的转化频率。因此,B. subtilis细胞间的遗传重组过程是一种介于转化与接合之间,依赖于活的供体细胞的类似于转化的过程。前期工作发现B. subtilis细胞间的遗传重组过程主要发生在固态基质表面且严重依赖于细胞密度,因此在琼脂平板上形成的重组子往往无法计数,供受体菌混合液经梯度稀释后得到的重组子数目与稀释梯度完全不成比例,因此为我们的后续研究带来了诸多不便。为了更深层次地了解B. subtilis细胞间遗传重组过程的发生机制,本研究建立了微孔滤膜上的B. subtilis细胞间遗传重组体系。在该体系中,供受体菌混合后滴加在置于固体选择平板上的微孔滤膜上,并培养一段时间,待细胞间的遗传重组过程发生后,再将滤膜上的菌苔洗下并进行梯度稀释,从而根据重组子数和受体菌数进行遗传重组频率的计算,该体系有利于更加科学的评估B. subtilis细胞间的遗传重组过程。对供受体细胞混合后在培养过程中的动态变化进行定点监测后发现,供受体菌混合液滴定至位于选择平板上的微孔滤膜上之后,大约从第10h之后,开始检测到重组子的产生,并且随着培养时间的延长,重组子的产生数量以及重组频率逐渐上升,20h之后,遗传重组频率趋于稳定。尽管缺陷性原噬菌体PBSX并不直接参与B. subtilis细胞间的遗传重组过程,但该噬菌体的存在对宿主菌遗传信息的保留依然起到了极为重要的作用。为了进一步验证缺陷性原噬菌体在B. subtilis中的普遍性,我们对中国典型培养物保藏中心保藏的39株具有不同来源的B. subtilis菌株进行了缺陷性原噬菌体普遍性调查。研究结果显示,60%以上的调查菌株都含有类似于PBSX的缺陷性原噬菌体,而工业菌株和自然界中分离到的野生株所携带的缺陷性原噬菌体具有丰富的多样性。在缺陷性原噬菌体普查过程中,我们意外地从一株短小芽胞杆菌（B.pumilus） AB94180中诱导出了一株只包裹了8kb DNA片段的缺陷性原噬菌体PBP180并对其进行了一系列特性分析。结果表明,PBP180在形态上类似于PBSX, SDS-PAGE分离到的结构蛋白带型类似但有别于PBSX,在敏感菌攻击范围上,PBP180和PBSX间存在较大差异。此外,对PBP180、PBSX编码基因以及另外两株B. pumilus （AB94044和SAFR-032）菌株中所携带的PBSX类原噬菌体编码基因进行比较分析后发现,这四株噬菌体的调控基因和大部分结构蛋白非常保守,而负责敏感菌识别和攻击的尾部蛋白在基因排布和同源性上都存在较大差异。综上所述,对B. subtilis细胞间遗传重组过程的特性研究,显示了DNA给体细胞在水平基因转移过程中扮演着以往为人们所忽视的重要作用,对该过程机理的揭示将有助于更深层次地理解水平基因转移过程的生物学意义。此外,Bpumilus AB94180中缺陷性原噬菌体PBP180的特性研究为该类噬菌体的进化研究和存在意义提供了更多的理论依据和实验证据。
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