Leptin在肝脏缺血—再灌注损伤中的变化规律及其重组、表达

论文摘要

目的：建立大鼠肝脏缺血-再灌注（Ischemia-Reperfusion，I／R）损伤模型，探讨大鼠肝脏I／R损伤时血清Leptin蛋白及脂肪组织Leptin mRNA水平的变化规律，探讨影响血清Leptin水平变化的因素，以及此变化规律对机体的影响。方法：将45只体重220g左右的雄性SD大鼠随机分为5组，第一组为假手术组（Sham组），第二组为肝脏缺血60min、再灌注60min（160R60）组，第三组为I60R150组，第四组为I60R240组，第五组为I60R360组。麻醉后，在门静脉分出发向肝脏尾叶的分支上，以动脉夹夹闭肝动脉、门静脉及胆管，建立大鼠肝脏70％I／R损伤模型。动脉夹置入后，关闭腹腔。缺血60min后，取出动脉夹进行再灌注。采用高灵敏鼠Leptin放射免疫分析法测定血清Leptin浓度变化，并采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测脂肪组织Leptin mRNA表达水平的变化。结果：（1）与Sham组（12.01±2.73 ng／ml）相比，I60R60组（17.77±5.61 ng／ml）和I60R150组（17.26±6.13 ng／ml）血清Leptin浓度即出现增高趋势，I60R360组（19.54±6.04 ng／ml）血清Leptin浓度显著增高（q=4.39，P＜0.05）。（2）与Sham组相比，I60R60组、I60R150组和I60R240组Leptin mRNA表达水平无明显改变，I60R360组Leptin mRNA表达水平降低（辉度比值q=4.56，P＜0.05）。结论：大鼠70％肝脏缺血-再灌注损伤模型建立成功。Leptin作为一种炎性因子，参与了大鼠肝脏I／R损伤的病理生理改变过程。大鼠血清Leptin浓度在肝脏I／R损伤早期和中期呈升高趋势，但脂肪组织Leptin mRNA表达水平在损伤后期呈下降趋势。目的：为了获得重组人Leptin（rh-leptin）蛋白高表达的菌株及大量具有生物活性的rh-leptin蛋白，构建Leptin重组表达载体，筛选阳性质粒，转化感受态细菌进行表达，对rh-leptin蛋白进行复性及纯化，并鉴定其免疫学及生物学活性。方法：提取脂肪组织RNA，通过RT-PCR方法获得用PCR方法扩增人Leptin的编码区，使产物与pGEM-T easy载体相连，转染DH5α。测序后，选出阳性克隆质粒扩增。将酶切后的leptin片段与pET-28a（+）载体连接，获得leptin的表达质粒。将重组表达质粒转入BL21（DE3），测序结果显示Leptin编码区没有突变产生，用IPTG诱导leptin重组蛋白表达。表达产物进行SDS-PAGE电泳及Western印迹杂交进行免疫学分析。并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性。结果：在包涵体蛋白22 kDa处有明显的新增蛋白带，其含量超过总蛋白的50％：经Western-blot证实为重组的人leptin蛋白。大量表达后，经蛋白复性和纯化，通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验证实重组表达的人Leptin蛋白具有生物学活性。结论：成功构建了rh-leptin的高表达菌株，建立了rh-leptin的纯化与复性方法，经验证表达产物具有免疫学及生物学活性，可供进一步基础及临床研究应用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 第一部分 肝脏缺血—再灌注损伤对大鼠Leptin蛋白及mRNA表达水平的影响
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 重组人Leptin的表达、纯化及免疫学与生物学活性鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 英文缩写词索引
• 攻读学位期间发表文章
• 致谢