论文摘要
目的构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体和缺失NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体,观察其在真核细胞中表达情况,探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的四段不同长度的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这四段序列片段进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-N3-NOD2（617bp）wt、pEGFP-N3-NOD2（747 bp）wt、pEGFP-N3-NOD2（1136 bp）wt、pEGFP-N3-NOD2（1387 bp）wt,将构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导瞬时转染HEK293细胞、Hela细胞及ECV304细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白（greenfluorescent proteins,GFP）。用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2（617 bp）wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染Hela细胞及HEK293细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功。细胞转染结果表明,构建的重组质粒转染HEK293、Hela及ECV304细胞株后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,含有NF-κB结合位点的不同长度的人NOD2启动子片段驱动的绿色荧光蛋白的表达的强度相同（P＞0.05）,其中构建的pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在Hela及HEK293细胞中绿色荧光表达明显强于突变质粒mpEGFP-N3-NOD2的表达（P＜0.05）。结论（1）成功构建了含有NF-κB结合位点的不同长度的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;（2）含有NF-κB结合位点的不同长度的人NOD2启动子片段驱动的绿色荧光蛋白的表达强度相同,说明含有NF-κB结合位点的不同长度人NOD2启动子效率相同;（3）NF-κB结合位点突变重组质粒在Hela细胞及HEK293细胞中绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中可能发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。
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