苏云金杆菌营养期杀虫蛋白vip3基因及其在转基因水稻中的应用

论文摘要

苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种广泛应用于农业害虫生防的细菌。许多Bt菌株在营养生长期分泌一种对鳞翅目昆虫有杀虫活性的蛋白质Vip3。研究表明Vip3与广泛使用的Bt晶体杀虫毒素在进化上没有同源性,并且在杀虫机理上也不相同。本论文描述了一种在Bt菌株中发现新型Vip3的方法,研究了不同Vip3及其嵌合蛋白（两种Vip3杂交获得的人工蛋白）的特性,并首次以抗Bt晶体杀虫毒素的害虫为对象研究了Vip3和Cry1Ac的交互抗性问题。进一步,我们设计了由一种晶体杀虫毒素和一种Vip3蛋白质融合的基因cry1Abvip3H,并将其转入水稻,获得了转基因抗虫水稻。通过设计不同PCR引物,利用PCR的方法筛选了500个Bt分离株,获得了可能含有新vip3基因的Bt菌株。其中从一个Bt菌株克隆获得了vip3Ab2全基因,并在大肠杆菌中获得了表达。生物测定发现,Vip3Ab2对秋黏虫和美洲棉铃虫的杀虫活性很高,但对家蚕的杀虫活性很低。进一步,为了改良Vip3的杀虫能力,Vip3Ab2和另外一个Vip3蛋白质Vip3Aa1杂交获得2个嵌和蛋白Vip3AbAa（由Vip3Ab2的N-端1-600个氨基酸和Vip3Aa1的C-端601-789个氨基酸组成）和Vip3AaAb（由Vip3Aa1的N-端1-600个氨基酸和Vip3Ab2的C-端601-788个氨基酸组成）。生物测定发现,相对于Vip3Ab2和Vip3Aa1,Vip3haAb的杀虫活性大幅降低,而Vip3AbAa对秋黏虫、粉纹夜蛾和家蚕的活性均增加。特别是,Vip3Ab2和Vip3Aa1对欧洲玉米螟均没有杀虫活性,Vip3AbAa则表现出对欧洲玉米螟的杀虫活性。比较了Vip3对敏感和抗Cry1Ac的粉纹夜蛾的杀虫活性差异。结果显示,Vip3Ab2、Vip3Aa1和Vip3AbAa对敏感和抗性昆虫都具有很高杀虫活性。这说明Vip3A和Cry1A这两种蛋白无交互抗性。因此,vip3A基因可以用来产生转基因抗虫作物来控制害虫抗性的发展。根据单子叶植物的DNA密码偏好性人工合成vip3H和cry1Ab基因,并设计了一个cry1Abvip3H融合基因。在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达的这种融合蛋白在使用胰蛋白酶降解后,利用Vip3的抗体对降解情况的进行免疫分析。结果发现,融合蛋白可以被降解为抗胰蛋白酶的62kDa的Vip3核心蛋白。生物测定表明,在E.coli中表达的Cry1AbVip3H对秋黏虫、棉铃虫、美洲棉铃虫、小地老虎和烟芽夜蛾均有杀虫活性。利用玉米泛素启动子控制融合基因,通过农杆菌（Agrobacteriumtumefaciems）转导获得转基因水稻。Western Bolt检测结果显示,转基因水稻各个组织均可以表达Cry1AbVip3H,表达量从多到少依次为叶片、茎杆、根和种子。而且,转基因抗虫水稻在小规模田间试验时对稻纵卷叶螟抗虫效果良好。说明本研究获得的转基因水稻可以培育抗虫转基因水稻。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 附表
• 插图
• 昆虫中文名、英文名、缩写和拉丁名对照
• 1.苏云金杆菌营养期杀虫蛋白研究进展
• 1.1 Vip3基本特性
• 1.2 Vip3类型
• 1.3 Vip3杀虫活性
• 1.4 Vip3作用机理
• 1.5 vip3基因应用
• 1.5.1 vip3基因重组
• 1.5.2 转vip3基因作物
• 1.6 展望
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒载体
• 2.1.3 限制性内切酶、连接酶以及其他酶类
• 2.1.4 试剂盒及Marker
• 2.1.5 溶液
• 2.1.6 使用仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 Bt质粒抽提
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 PCR产物加A
• 2.2.4 凝胶回收
• 2.2.5 感受态制备
• 2.2.6 T克隆
• 2.2.7 表达载体构建
• 2.2.8 基因表达
• 2.2.9 SDS-PAGE电泳
• 2.2.10 Western Blot
• 2.2.11 多克隆抗体制备
• 2.2.12 生物测定
• 3.嵌和Vip3毒素特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 PCR筛选vip3新基因
• 3.1.2 克隆vip3新基因
• 3.1.2.1 构建Bt菌株LG13小型文库
• 3.1.2.2 PCR筛选Bt菌株LG13小型文库
• 3.1.2.3 克隆Bt菌株LG13中vip3新基因
• 3.1.3 克隆vip3Aa1基因
• 3.1.4 构建vip3Aa1和vip3Ab2嵌和基因
• 3.1.5 表达vip3Aa1、vip3Ab2及其嵌和基因
• 3.1.6 Vip3Aa1、Vip3Ab2及其嵌和蛋白的生物测定
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 vip3Aa1和vip3Ab2及其嵌和基因的克隆
• 3.2.2 Vip3Aa1和Vip3Ab2及其嵌和蛋白的表达
• 3.2.3 Vip3Aa1和Vip3Ab2及其嵌和蛋白的杀虫活性
• 3.2.4 Vip3Aa1和Vip3Ab2及其嵌和蛋白与Cry1Ac的交互抗性
• 3.3 讨论
• 4.vip3在转基因水稻中的应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 合成cry1Abvip3H融合基因
• 4.1.2 在大肠杆菌中表达vip3H基因
• 4.1.3 在大肠杆菌中表达cry1Abvip3H融合基因
• 4.1.4 制备Vip3H多克隆抗体
• 4.1.5 胰蛋白酶降解Vip3H和Cry1AbVip3H
• 4.1.6 培育转cry1Abvip3H基因抗虫水稻
• 4.1.6.1 构建cry1Abvip3H基因载体
• 4.1.6.2 构建抗草甘磷基因载体
• 4.1.6.3 构建抗虫抗草甘磷转基因水稻T-DNA载体
• 4.1.6.4 转基因水稻培养
• 4.1.6.5 转基因水稻中融合蛋白检测
• 4.1.7 生物测定
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 Vip3H以及Cry1AbVip3H的原核表达
• 4.2.2 Vip3H以及Cry1AbVip3H对蛋白酶的稳定性
• 4.2.3 Vip3H以及Cry1AbVip3H的生物测定
• 4.2.4 转基因水稻的特性
• 4.3 讨论
• 5.总讨论
• 参考文献
• 附录Ⅰ溶液
• 分子生物学实验溶液
• 转基因水稻基本培养基溶液
• 附录Ⅱ仪器
• 作者简介