论文摘要
大豆茎褐腐病,简称BSR,最早于1940年在美国被报道,它的主要寄主是大豆,另外在绿豆和赤豆上也有发现。它是由Phialophora gregata f.sp.sojae引起的一种土传性的维管束类病害。其病菌可以在土壤中存活多年,对大豆的生产造成很大威胁,且该病原菌难以分离,病程缓慢。其症状与大豆猝死综合症极其相似,目前主要分布在美国,巴西,日本,加拿大和阿根廷。近年来随着大豆进口量的增加,可能携带了一定数量的豆杆和土壤。为了防止此病通过贸易传入我国,保护我国的大豆生产,本研究确立了大豆茎褐腐病菌的检测技术,并应用此技术对纯菌株进行检测。针对PG（Phialophora gregata f.sp.sojae）在ITS区的特点,参照引物设计原则,设计并筛选出了一对引物Pg1/4。引物序列为,Pg1:5’-agagcaaaggatagggagca-3’Pg4:5’-tggcatgtagacctgcca-3’。共提取了包含BSR的菌株Pgs1以及BSR近似种的9个种的13菌株的DNA。采用Pg1/4对进行扩增,只有Pgs1能特异性的扩增出502bp的条带。优化PCR反应条件,得到最佳退火温度为59℃。检测灵敏度为4.2×101pg/μL的DNA。同时,设计出PG的特异性荧光引物和探针,BSR-1F:5’-ccaaccagggccgatcag-3’;BSR-1R:5’-cggattcagcgtaaaaaatgg-3’;Taqman探针BSR-1M:5’-6FAM-ctcccctatggtttct-MGBNFQ-3’。特异性试验证实,该方法只能检测到pgs1,与其他12个菌株没有交叉反应,具有高度的特异性。优化反应条件,采用25μL体积反应体系,0.4μmol/L的引物浓度和0.2μmol/L的探针浓度。此检测灵敏度为4.2×10-4pg/μL的DNA,是常规PCR的100000倍。两者相结合大大增加了检测的准确性和灵敏度。最后,采用Pg1/4对接种Pgs1（ATCC204452）的大豆进行检测,能够准确检出病原。
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摘要Abstract第一章 文献综述1 大豆茎褐腐病的发生情况1.1 大豆茎褐腐病的分布1.2 大豆茎褐腐病的危害及损失2 大豆茎褐腐病的研究现状2.1 病原菌2.2 病原菌生物学特性2.3 病原菌致病性分化2.4 症状2.5 病害侵染循环与传播途径2.6 病原菌的分离与鉴定2.6.1 形态观察2.6.2 选择性培养基2.6.3 分子生物学方法3 病害防治3.1 药剂防治3.2 农业防治3.3 品种抗性利用4 中国对进口大豆的检疫状况5 本研究的目的和意义5.1 研究的目的5.2 研究的意义第二章 大豆茎褐腐病菌的分子检测1 材料1.1 供试菌株1.2.1 仪器1.2.2 试剂2 方法2.1 试剂和培养基的配制2.2 固体培养基培养和液体培养基振荡培养2.3 真菌菌丝核酸的提取2.4 引物设计2.4.1 真菌通用引物ITS4/52.4.2 BSR病原菌ITS区特异引物的设计2.5 PCR反应2.5.1 PCR反应体系及扩增条件2.5.2 真菌通用引物的常规PCR反应2.5.3 BSR特异性引物的筛选2.5.4 BSR特异性引物PCR反应的条件优化2.5.5 PCR产物电泳分析2.6 PCR产物的克隆和序列测定2.6.1 PCR产物的回收2.6.2 连接2.6.3 转化2.6.4 克隆筛选和测序2.7 接种植物提取物的分子检测2.8 BSR的实时荧光PCR反应2.8.1 实时荧光PCR反应体系及条件2.8.2 实时荧光PCR特异性引物的筛选2.8.3 实时荧光PCR特异性引物的灵敏度测试3 结果和分析3.1 PCR反应结果3.1.1 真菌通用引物ITS4/5的PCR反应结果3.1.2 引物筛选结果3.1.3 PCR反应结果及优化3.1.4 特异性引物Pg1/4的特异性3.1.5 特异性引物Pg1/4的灵敏度测试3.2 测序结果3.3 实时荧光PCR反应结果3.3.1 实时荧光PCR反应优化条件3.3.2 实时荧光PCR的特异性3.3.3 实时荧光的灵敏度3.3.4 绝对定量标准曲线的建立3.3.5 BSR荧光定量PCR的重复性和稳定性3.4 供试菌株回接寄主植物3.4.1 接种成功后的症状3.4.2 接种植物PCR反应结果第三章 结论和讨论1 结论1.1 PCR与荧光PCR的结合2 讨论参考文献致谢作者简历
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- [1].大豆茎褐腐病病原菌鉴定[J]. 中国油料作物学报 2013(02)
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