论文摘要
随着现代神经生物学的发展及社会-心理-生物医学模式的提出,神经系统对疾病的影响越来越受人们关注,特别是体内重要的神经递质,其功能也日益被延伸,近年来研究发现肿瘤细胞上存在多种神经递质受体,而且不少神经递质具有影响肿瘤细胞生长、迁移、侵袭和转移的作用;γ-氨基丁酸（GABA）是体内重要的抑制性神经递质,它不仅扮演着调节中枢神经的功能,而且对恶性肿瘤的发生发展起着作用;同时神经内分泌系统调节着胆管上皮细胞的病理生理,很多激素、神经肽和神经递质能够影响胆管上皮细胞的生物学特性,但GABA对胆管癌的作用未明;本实验通过体外实验初步探讨抑制性神经递质——GABA对胆管癌细胞增殖和侵袭转移的影响,并通过各种经典的分子生物学方法,研究其内在的相关机制,为阐明GABA的药理作用提供事实依据,也为胆管癌的辅助治疗提供新的思路和方案。目的探讨抑制性神经递质——γ-氨基丁酸对胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭转移的影响,并揭示该影响的内在分子机制。方法常规体外培养胆管癌细胞株QBC939,每日倒置显微镜下观察细胞生长情况。应用不同浓度的GABA处理生长对数期细胞,于作用后的不同时间段收集细胞。采用MTT比色法探讨GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,PCR-ELISA法观察其对细胞QBC939端粒酶活性的影响,放射免疫分析法检测癌细胞内cAMP含量。Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析GABA对胆管癌细胞QBC939表达基质金属蛋白酶2、9 （matrix metalloproteinase, MMP2、9） mRNA的影响,明胶酶谱法分析GABA对癌细胞上清液中MMP2、MMP9活性的影响结果（1）MTT显示GABA在体外明显抑制细胞QBC939的增殖,抑制作用与药物浓度具有明显的依赖性,随着浓度的增加（1-1000μmol/L）,胆管癌细胞的增殖抑制率由2.6%增至26.82%（48h,P<0.05）,但没有明显的时间依赖性,以作用48h后抑制效果最明显。（2）流式细胞术检测显示GABA促进细胞凋亡（凋亡率由4.8%增至28.03%,P<0.05）,并呈剂量依赖性,对细胞周期无明显影响。（3）与对照组相比,从浓度为10μmol/L的GABA开始,胆管癌细胞中的端粒酶活性即受到明显抑制（0.82±0.048 vs 0.69±0.027,P<0.05）,该效应也呈剂量依赖性。（4）放射免疫分析法显示GABA促进胆管癌细胞QBC939内cAMP的生成（100μmol/L,0.59±0.049 nmol/L vs 0.71±0.029nmol/L ,P<0.05）,呈剂量依赖性。（5）Transwell小室法分析,GABA抑制胆管癌细胞QBC939穿透Matrigel膜的能力（100μmol/L的GABA,穿透细胞数42.67±4.04 vs 60±9.54个, P< 0.05）,剂量增加效应越明显,成剂量依赖性。（6）GABA作用胆管癌细胞QBC939后,基质蛋白酶MMP-2和MMP-9 mRNA的表达减少（100μmol/L处, MMP-2 mRNA : 0.632±0.065 vs 1.107±0.271,MMP-9 mRNA :0.605±0.104 vs 0.891±0.167,P<0.05）,胞液中MMP-2和MMP-9的活性下降（1000μmol/L处,Vmmp-2: 46.1±0.025 vs 73.2±0.14,Vmmp-9:11.2±0.035 vs 32.6±0.071,P<0.05）,这两种作用均呈剂量依赖性。结论（1）不同浓度的GABA在体外可以抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,该效应呈剂量依赖性,可能的信号传到途径是通过受体后的第二信使——cAMP的信息介导途径,诱导胆管癌细胞凋亡,抑制胆管癌细胞端粒酶的活性。（2）抑制性神经递质——GABA在体外能够减弱胆管癌细胞QBC939侵袭转移能力,其机制与其抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和活性有关
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