旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子TsCystatin1的克隆、表达及鉴定

论文摘要

旋毛虫是一种细胞内寄生性线虫,其生活史可以在同一宿主内完成,宿主感染谱极广,几乎所有的哺乳动物均可感染。旋毛虫感染引起的旋毛虫病是一种危害极其严重的食源性人兽共患寄生虫病。半胱氨酸蛋白酶抑制因子是一类广泛存在于生物体的半胱氨酸蛋白酶高效内源性抑制剂。寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫逃避宿主免疫应答、适应寄生生活中发挥着重要作用。寄生性线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的免疫调控作用,在寄生虫入侵宿主时对宿主免疫应答的抑制起重要作用,是诱导宿主免疫抑制的重要因子之一。本研究根据旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因（TsCystatin1）EST序列设计引物为上游引物,以PolyT为下游引物对旋毛虫新生幼虫总RNA进行RT-PCR,克隆获得具有完整开放阅读框（ORF）的TsCystatin1 cDNA序列。序列分析结果表明TsCystatin1基因开放阅读框为669 bp,编码221个氨基酸,具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制因子保守氨基酸序列。旋毛虫基因组DNA分析表明该基因由两个外显子和一个80 bp的内含子组成。对旋毛虫成虫、新生幼虫以及旋毛虫感染不同时期的肌幼虫分别进行RT-PCR和实时荧光定量PCR,结果表明该基因在旋毛虫各个发育时期均有表达。将TsCystatin1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组表达质粒pGEX-4T-TsCystatin1,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21后诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明,该基因在原核表达系统中得到了高效表达,产物分子量约为48.3 ku,在低温条件下诱导表达产物主要以可溶性形式存在。将重组抗原免疫兔制备高免血清,该抗体可以识别旋毛虫肌幼虫抗原约44.0 ku的条带。酶活性研究表明,该重组蛋白可以抑制组织蛋白酶B的活性。Werthern-blot试验结果显示,该重组蛋白与旋毛虫感染血清反应不明显。将该重组抗原免疫动物后没有明显的保护性。本研究为进一步研究TsCystatin1基因的生物学功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 寄生虫Cystatin 的类型与结构特征
• 1.1.1 Stefin 家族
• 1.1.2 Cystatin 家族
• 1.1.3 Kininogen 家族
• 1.1.4 phytocystatin 家族
• 1.1.5 Cystatin 同源分子
• 1.2 作用机制
• 1.3 生物学功能
• 1.4 寄生性蠕虫Cystatin
• 1.4.1 线虫的cystatin
• 1.4.2 吸虫的cystatin
• 1.4.3 绦虫的cystatin
• 1.5 展望
• 第二章 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因TsCystatin1 的克隆及分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 旋毛虫cystatin 基因的克隆
• 2.2.2 旋毛虫Tscystatin1 基因序列分析
• 2.2.3 TsCystatin1 的生物信息学分析
• 2.2.4 线虫cystatin 蛋白同源性比对分析
• 2.2.5 TsCystatin1 基因组DNA 分析
• 2.2.6 旋毛虫TsCystain1 基因在不同发育时期的转录
• 2.3 讨论
• 第三章 旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因TsCystatin1 的表达及鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 旋毛虫TsCystatin1 基因片段的扩增
• 3.2.2 pGEX-4T-TsCystatin1 重组表达质粒的构建及鉴定
• 3.2.3 TsCystatin1 重组蛋白的表达及纯化
• 3.2.4 TsCystatin1 重组蛋白免疫兔血清抗体效价检测
• 3.2.5 旋毛虫肌幼虫可溶性蛋白中TsCystatin1 的检测
• 3.2.6 TsCystatin1 重组蛋白的反应原性
• 3.2.7 TsCystatin1 重组蛋白的免疫原性
• 3.2.8 pcDNA3.1-TsCystatin1 核酸疫苗鉴定
• 3.2.9 重组蛋白半胱氨酸蛋白酶抑制活性
• 3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历