论文摘要
蜡样芽孢杆菌A-47菌株（Bacillus cereus A-47）是本研究室从植物体内分离得到的一株植物内生有益蜡样芽孢杆菌,它对多种作物具有良好的防病、促生作用,可以改善品质、提高抗逆性等。At7基因是本试验室与有关试验室合作,利用SSH方法从海岛棉中分离得到的与黄萎菌毒素互作的全长cDNA,经序列比对确认其为LTP。pGFP4412是本试验室在pBE2质粒基础上构建的大肠杆菌—芽孢杆菌穿梭载体。 本研究利用多次PCR将芽孢杆菌Mn-SOD基因的信号肽序列加在At7基因的5’端,然后将连有信号肽的At7基因与载体pGFP4412连接,构建了重组载体pSAt7-4412。将重组载体转化蜡样芽孢杆菌A-47菌株,得到了转基因工程菌株。对工程菌株质粒遗传稳定性研究表明,重组质粒pSAt7-4412的稳定性为92.2%。 用平板测定方法,研究了转基因工程菌对棉花黄萎菌的抑制作用;同时利用液体PDA培养基共培养转基因工程菌和棉花黄萎菌,再检测黄萎菌的毒素致萎性。通过比较工程菌株与野生菌株分别和黄萎菌共培养上清液对棉花叶片的致萎效果,结果工程菌株与黄萎菌共培养可以显著降低棉花黄萎菌的致萎力。由此可见,At7基因能在植物内生有益芽孢杆菌A-47中表达和外泌,并且对黄萎菌具有较好的抑菌活性。此外,通过工程菌株与野生菌株对小麦的促生作用研究,结果显示二者没有本质差异,由此表明转At7后并未对野生菌株的有益性状产生不利影响。 At7基因和原核表达载体的重组子pET-28a-At7转化大肠杆菌BL21,由IPTG进行诱导表达,再用SDS-PAGE检测蛋白产率。结果表明,At7基因在大肠杆菌中获得了高效表达,在IPTG诱导4h时蛋白表达量达到最高。将纯化后的AT7蛋白免疫大白兔,制备了高特异性的抗血清。微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法测定效价为1/16384(1/214),表明抗血清的效价高,并可特异性地检测At7在芽孢杆菌A-47中的表达。