家蚕核型多角体病毒多角体单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

杆状病毒（baculovirus）是外形呈杆状的双链闭环的DNA大形病毒,杆状病毒主要以鳞翅目昆虫为宿主,其复制和装配是在宿主的细胞核内进行的。杆状病毒的病毒粒子常被特别地包裹在坚固的晶体颗粒中,这种晶体颗粒被称之为多角体（polyhedra）,多角体就像一个包裹,在不利的环境中可以保护有传染性的病毒粒子得以长期生存。多角体蛋白（polyhedrin）是病毒蛋白中最保守的蛋白之一,但多角体蛋白的结构以及多角体的包装机制目前仍未明确。为更进一步地研究这些机制,还有赖于更有效的检测方法。本研究运用杂交瘤技术制备了家蚕核型多角体病毒（BmNPV）多角体的单克隆抗体（mAb）,并对之进行了鉴定。主要研究和结果如下:1. BmNPV多角体mAb的制备运用差速离心将BmNPV多角体颗粒分离纯化,再通过腹腔注射（IP）方式将已纯化过的BmNPV多角体颗粒直接免疫BaLb/c小鼠。然后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇（PEG-4000）作用下进行细胞融合,并用HAT培养基对融合的杂交瘤细胞进行选择性培养。运用间接ELISA检测,对能分泌抗BmNPV多角体抗体的杂交瘤细胞多次进行有限稀释法亚克隆培养。最终筛选出了一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,命名为D7。4个月内经连续传代和3次冻存复苏后,D7仍能稳定分泌抗体,说明该株杂交瘤细胞分泌单抗的能力稳定,具有较好的遗传稳定性。2. BmNPV多角体mAb的鉴定对阳性杂交瘤细胞染色体、mAb亚类、效价和特异性等分别进行了鉴定。将D7染色体计数,发现其染色体数为99～108条,从遗传角度证明确实获得了杂交瘤细胞株。MAb亚型测定为IgG2a,轻链为kappa型,腹水ELISA效价为1:106～1:107。对获得的mAb采用Western blot方法分析,发现其与BmNPV多角体具有良好的特异性反应,与AcNPV、ClbiNPV和EoNPV多角体无交叉反应,而与ApNPV和PcrNPV多角体存在交叉反应。3. BmNPV多角体mAb抗原表位的初步定位实验运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建并验证了一系列重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）,这些重组杆状病毒中融合有不同长度的BmNPV多角体片段（F1-6）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。用这些病毒感染昆虫细胞,六种不同长度的蛋白F1-6-EGFP被表达出来。运用Western blot分析,mAb的抗原表位被初步界定在BmNPV多角体氨基酸序列100-180间。综上,本研究运用杂交瘤技术,建立了一株能稳定分泌抗BmNPV多角体mAb的杂交瘤细胞株,并对其生产的mAb进行了初步鉴定。抗BmNPV多角体mAb的成功制备为进一步研究杆状病毒以及其他相关方面的问题奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 杆状病毒研究进展
• 1.1.1 杆状病毒及其分类
• 1.1.2 杆状病毒发育循环和感染周期
• 1.1.3 杆状病毒分子生物学研究
• 1.1.4 杆状病毒多角体蛋白
• 1.1.5 杆状病毒的用途
• 1.1.6 杆状病毒与抗体
• 1.2 主要相关技术介绍
• 1.2.1 单克隆抗体技术
• 1.2.2 抗原表位鉴定技术
• 1.2.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达技术
• 1.3 本研究的目的意义和主要内容
• 1.3.1 本研究的目的意义
• 1.3.2 本研究的主要内容
• 第二章 Bm NPV多角体蛋白单克隆抗体的制备
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物、细胞和毒株
• 2.1.2 主要试剂、溶液和培养基配制
• 2.1.3 主要实验用品和仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 BaLb/c小鼠免疫
• 2.2.2 BmNPV多角体间接ELISA和鼠抗血清的抗体效价检测
• 2.2.3 细胞融合和HAT培养基选择培养
• 2.2.4 有限稀释法亚克隆培养与阳性杂交瘤细胞系筛选
• 2.2.5 杂交瘤细胞的扩大培养与冻存
• 2.2.6 单克隆抗体的大量制备、纯化及保存
• 2.3 结果
• 2.3.1 BaLb/c小鼠免疫和间接ELISA检测鼠抗血清抗体效价
• 2.3.2 杂交瘤细胞融合筛选结果和阳性杂交瘤细胞系的建立
• 2.4 讨论
• 第三章 Bm NPV多角体蛋白单克隆抗体的鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞和毒株
• 3.1.2 主要试剂和溶液配制
• 3.1.3 主要实验仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 阳性杂交瘤细胞染色体分析
• 3.2.2 腹水单抗效价测定
• 3.2.3 单克隆抗体Ig类、亚类和轻链的鉴定
• 3.2.4 单克隆抗体的Western blot鉴定
• 3.2.5 BmNPV多角体单抗交叉反应实验
• 3.2.6 多种多角体抗原决定簇表位比较
• 3.3 结果
• 3.3.1 阳性杂交瘤细胞染色体特征
• 3.3.2 腹水单抗效价
• 3.3.3 单克隆抗体Ig类、亚类和轻链特征
• 3.3.4 单克隆抗体的Western blot结果
• 3.3.5 BmNPV多角体单抗交叉反应结果
• 3.3.6 多种多角体抗原决定簇表位比较结果
• 3.4 讨论
• 第四章 Bm NPV多角体单克隆抗体抗原表位的初步鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 质粒、菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要缓冲液配置
• 4.1.4 主要培养基和平板配制
• 4.1.5 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物设计与合成
• 4.2.2 F1-F6 片段的PCR
• 4.2.3 连接反应
• 4.2.4 感受态细胞制备
• 4.2.5 质粒DNA转化
• 4.2.6 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA
• 4.2.7 质粒 DNA 酶切鉴定
• 4.2.8 重组转座载体的构建
• 4.2.9 重组Bacmid穿梭载体的构建
• 4.2.10 重组Bacmid的提取
• 4.2.11 重组Bacmid的PCR鉴定
• 4.2.12 Tn细胞的培养
• 4.2.13 重组Bacmid转染Tn细胞
• 4.2.14 重组F1-6-EGFP杆状病毒的蛋白表达
• 4.2.15 Western blot分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组转座载体pFastBac- F1-6-EGFP的酶切鉴定
• 4.3.2 重组穿梭载体bacmid的PCR鉴定
• 4.3.3 重组F1-6-EGFP杆状病毒感染Tn细胞的观察
• 4.3.4 BmNPV多角体片段F1-6-EGFP的Western blot结果
• 4.4 讨论
• 第五章 总结和展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间主要科研工作和相关论文