孤雌生殖卤虫卵母细胞中休眠卵发育相关基因的分离分析

论文摘要

卤虫（Artemia）,也叫盐水丰年虾（Brine Shrimp）,属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、鳃足亚纲（Branchiopoda）、无甲目（Anostacea）、卤虫科（Artemidae）、卤虫属（Artemia）,广泛分布于内陆盐湖中。卤虫是目前已知耐盐范围最宽的多细胞动物。卤虫的胚胎具有两种发育方式:一种是卵生（oviparity）,产生休眠卵（diapause cyst）,此时胚胎停滞在原肠胚时期,休眠胚胎被厚厚的外壳包被,具有极低的代谢活性和很强的抗逆性,只有经历特殊的环境条件才能继续发育;另一种是卵胎生（ovoviviparity）,直接产生无节幼体（nauplius）或先产生有薄外壳包被的卵并发育成无节幼体。为了探索卤虫休眠生殖发育方式调节的分子机制,我们运用消减杂交方法从卤虫（Artemia parthenogenetica,尕海湖）的将要经历休眠生殖方式的卵母细胞中克隆了大量基因的cDNA。主要研究结果可以分为以下三部分:1)、为了开发全长cDNA消减杂交技术,我们首先改进了一种基于PCR的双链cDNA合成方法,使合成的双链cDNA中全长cDNA的比例增加,同时系统分析了PCR抑制性作用（PCR-suppression effect,PS-effect）的各影响因素,并利用PS-effect对小分子抑制作用更强的特点选择性的富集双链cDNA中大分子;2)、开发了双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交（Duplex-specific nuclease-mediated normalization andsubtractive hybridization,DNSH）,模型实验表明该方法能够使只占mRNA总含量0.0001%的差异表达的基因能够被有效富集,并且能够得到其全长cDNA;3)、运用DNSH,使将要卵胎生的卤虫卵母细胞去消减将要卵生的卵母细胞,分离并分析了将要产休眠卵卤虫侧囊中卵母细胞的692个cDNA克隆,其中有323个与GenBank上已有的序列具有相似性。这692个cDNA共组装成600个cDNA重叠群（contig）,其中单一的（singleton）有529,占了大部分。我们选择了其中44个功能各异的基因（来源于56个克隆）进行荧光定量PCR分析,它们之间的mRNA水平差异最大达到约15,000倍。这其中,11个基因（21个克隆）的表达量在将产休眠卵的卤虫卵母细胞中显著性上调（p＜0.05）,另有7个基因（9个克隆）的表达量显著性下调（p＜0.05）。由此表明卤虫的生殖方式在卵母细胞中就已经决定了。总之,我们成功运用消减杂交在卤虫的卵母细胞中分离和分析了大量功能和表达量各异的基因的cDNA,表明将要经历不同胚胎发育方式卤虫的卵母细胞中就已经有大量不同功能基因差异表达,这也说明了卤虫的胚胎发育方式在之前的卵母细胞中就注定了。本研究结果为更深入的探索卤虫休眠卵的生殖发育研究提供了宝贵的信息。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 本文主要缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 卤虫休眠生殖相关研究
• 1.2 实验方法的选择
• 1.3 展望
• 1.4 参考文献
• 2 PCR抑制性作用的分析和运用
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 配制引物和接头
• 2.2.2 PCR程序
• 2.2.3 模型实验
• 2.2.4 扩增基因组DNA的限制性片段
• 2.2.5 从少量RNA中扩增cDNA
• 2.3 结果
• 2.3.1 PCR抑制性作用的动态分析
• 2.3.2 模型实验
• 2.3.3 偏好性地扩增基因组DNA的限制性片段
• 2.3.4 PS-effect在cDNA扩增中的应用
• 2.4 讨论
• 2.5 参考文献
• 3 双链特异性DNA酶介导的均一化消减杂交
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 配制引物和接头
• 3.2.2 Betaine、trehalose和DMSO对DNA的Tm的影响
• 3.2.3 DSN酶的活性和热稳定性
• 3.2.4 检测DNSH的效率
• 3.3 结果
• 3.3.1 甜菜碱、海藻糖和DMSO降低DNA的熔解温度
• 3.3.2 Betaine、trehalose和DMSO可以和 DSN共用
• 3.3.3 DNSH的消减效率
• 3.4 参考文献
• 4 卤虫休眠卵生殖相关基因的分离分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 配制引物和接头
• 4.2.2 卤虫的养殖和操作
• 4.2.3 RNA抽提
• 4.2.4 DSN介导的均一化消减杂交
• 4.2.5 基因序列分析
• 4.2.6 差异表达基因的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 孤雌生殖卤虫的卵生和卵胎生
• 4.3.2 卤虫的卵母细胞cDNA的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 几丁质结合蛋白
• 4.4.2 主要易化扩散载体家族
• 4.4.3 分子伴侣
• 4.4.4 细胞周期调控蛋白
• 4.4.5 转录因子
• 4.4.6 转座元件
• 4.5 参考文献
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 本研究的创新点
• 附录1 编码蛋白质的cDNA分类
• 附录2 常用试剂配制
• 作者简历