论文摘要
轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras）成员，作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原在世界范围内广泛流行，特别是在发展中国家每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。随着分子生物学的深入研究，现已证明VP4蛋白是RV的外衣壳蛋白，介导病毒的吸附和穿入，使病毒具有致病性；VP4还是一种中和抗原，其中和抗原位于保守的VP4抗原表位区，自然感染时能刺激机体产生中和抗体。本实验选择乳酸菌作为受体菌株表达外源基因Vp4，即可将乳酸菌的益生功能和外源基因的特异性免疫相结合，从而研制猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌。目的在于为开发研制预防猪轮状病毒病的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基础。本研究采用现代分子生物学技术以SalI和KpnI双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和以胸苷酸合成酶基因（Thymidylate synthase，ThyA）及红霉素基因（Erythromycin）为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的质粒载体pW425et，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4。经筛选表达的阳性重组质粒应用电穿孔转化实验转化入嗜酸乳杆菌受体菌株中，筛选表达的阳性重组乳酸菌大量培养，离心加入灭菌脱脂乳液给BALB／c小鼠口服，应用ELISA方法检测血清抗体水平，应用小鼠SIgA试剂盒检测肠黏膜SIgA水平，应用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况。最后用SPSS11.0统计软件对以上所得数据进行分析比较。试验结果表明，猪A组轮状病毒Vp4基因在乳酸菌中表达获得了基因工程乳酸菌，将猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌给小鼠免疫后，具有较好的免疫效果。从而为进一步研究猪轮状病毒基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基础。