马铃薯早疫病菌（Alternaria alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性风险及分子机制研究

论文摘要

本论文采用真菌传统鉴定方法与分子生物学技术鉴定了河北省马铃薯早疫病病原菌种类,并采用菌丝生长速率法测定了采自河北省马铃薯主产区的早疫病菌对异菌脲和咯菌腈的敏感性,分别建立了早疫病菌对异菌脲和咯菌腈的敏感基线,评估了马铃薯早疫病菌对异菌脲和咯菌腈的抗性风险,并开展了抗性分子机制的研究。1马铃薯早疫病病原菌鉴定2009-2011年从河北省5个县采集180个早疫病菌标样,以常规方法进行分离及纯化,根据病原菌的形态特征和致病性,结合其rDNA-ITS区域的序列分析对病原菌进行鉴定。共分离到两种菌（A、B）,分离比例为4:6;致病性试验证实分离菌A和B均为马铃薯早疫病病原菌,经形态学鉴定,初步认定A为茄链格孢（Alternaria solani）,B为链格孢（Alternaria alternata）;采用通用引物ITS1/ITS4对病原菌A和B的rDNA-ITS序列区扩增并测序,通过与Genbank数据库比对,A与A. solani同源性为98%,B与A. alternata的同源性为100%,因此,将河北省马铃薯早疫病菌鉴定为茄链格孢（A. solani）和链格孢（A. alternata）。2马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的敏感性采用菌丝生长速率法测定河北省马铃薯主产区的85株早疫病菌对异菌脲的敏感性,结果表明,异菌脲对85株早疫病菌的EC50值介于0.23071.6464μg/mL之间,平均EC50值为0.5312±0.2124μg/mL,呈单峰近正态分布,尚未出现敏感性明显下降群体,为此可将供试菌株的平均EC50值作为马铃薯早疫病菌对异菌脲的敏感基线,用于将来开展田间抗性监测。咯菌腈对122株早疫病菌EC50值介于在0.00250.0857μg/mL之间,平均值为0.0404±0.0171μg/mL,相差34.87倍,呈单峰近正态分布,可作为早疫病菌对咯菌腈的敏感基线。3马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性风险评估采用紫外线诱变和药剂驯化的方法分别获得了7株和1株早疫病菌对异菌脲的抗性突变体,抗性倍数均在100倍以上,且抗性能稳定遗传;抗性突变体的菌丝生长速率、产孢能力和致病力均显著低于亲本敏感菌株;抗性突变体较亲本敏感菌株对NaCl渗透压更敏感,其菌丝细胞膜透性明显高于亲本敏感菌株;早疫病菌对异菌脲与腐霉利和咯菌腈之间表现正交互抗性关系,而与吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑之间无交互抗性关系。采用紫外线诱变的方法获得15株早疫病菌对咯菌腈的抗性突变体,抗性倍数均在10000倍以上,且抗性能稳定遗传;抗性突变体的菌丝生长速率、产孢能力和致病力均显著低于其亲本敏感菌株;抗性突变体较亲本敏感菌株对NaCl渗透压更敏感,其菌丝细胞膜透性明显高于亲本敏感菌株;早疫病菌对咯菌腈与异菌脲和腐霉利之间存在正交互抗性关系,而与苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯之间无交互抗性关系。综合分析表明,马铃薯早疫病菌对异菌脲和咯菌腈具有中等抗性风险,建议生产上将异菌脲或咯菌腈与其它无交互抗性关系的药剂交替或混合使用,以延缓抗药性的产生。4马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性分子机制紫外线诱导的抗异菌脲的突变体CC1-R1在组氨酸蛋白激酶保守区基因序列未发生碱基的突变;药剂驯化的抗性突变体CC1-R5在该序列的第6位碱基由T突变为G导致氨基酸从色氨酸（Trp）转化为甘氨酸（Gly）;紫外诱导的抗性突变体WC2-29-R1和WC2-29-R2在该序列分别有1个和16个碱基突变,但氨基酸序列没有发生变化。紫外线诱变的4个抗咯菌腈的突变体W15-R7、W15-R9、C7-1-R11、C7-1-R15在组氨酸蛋白激酶保守区基因序列的第366位的碱基均由T突变为C,同时W15-R7、C7-1-R11、C7-1-R15在该序列的836位的碱基由G突变为A,但两个位点的突变均未引起编码氨基酸的变化;C7-1-R11在该序列的1474位碱基的缺失导致组氨酸蛋白激酶氨基酸序列翻译的终止。由此可推测马铃薯早疫病菌对异菌脲和咯菌腈的抗性不只是由组氨酸激酶基因保守区域所控制的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 马铃薯早疫病的发生与危害
• 1.2 马铃薯早疫病的防治技术研究
• 1.2.1 病情预测预报
• 1.2.2 农业防治
• 1.2.3 生物防治
• 1.2.4 化学防治
• 1.3 早疫病菌抗药性研究现状
• 1.4 对二甲酰亚胺类杀菌剂（DCFs）抗性发生及机制研究
• 1.5 对吡咯类杀菌剂抗性发生及机制研究
• 1.6 植物病原菌抗药性检测
• 1.7 植物病原菌抗药性治理
• 1.8 研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 供试菌株
• 2.2 供试马铃薯品种
• 2.3 供试培养基
• 2.4 供试药剂
• 2.5 供试试剂
• 2.6 供试仪器
• 3 试验方法
• 3.1 马铃薯早疫病菌的分离与鉴定
• 3.1.1 病原菌分离与纯化
• 3.1.2 致病性测定
• 3.1.3 病原菌形态学特征观察
• 3.1.4 病原菌rDNA-ITS 的扩增与序列分析
• 3.2 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的敏感性测定
• 3.3 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性突变体获得及其生物学特性研究
• 3.3.1 紫外线诱变获得抗异菌脲的突变体
• 3.3.2 药剂驯化获得抗异菌脲的突变体
• 3.3.3 紫外线诱变获得抗咯菌腈的突变体
• 3.3.4 抗性突变体的抗性水平测定
• 3.3.5 抗性突变体与其亲本敏感菌株的生长速率及产孢量测定
• 3.3.6 抗性突变体遗传稳定性测定
• 3.3.7 致病力测定
• 3.3.8 交互抗性测定
• 3.3.9 抗性突变体与其亲本敏感菌株对NaCl 渗透压敏感性测定
• 3.3.10 抗性突变体与其亲本敏感菌株菌丝的细胞膜透性测定
• 3.4 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性分子机制研究
• 3.4.1 基因DNA 的提取
• 3.4.2 引物设计
• 3.4.4 琼脂糖凝胶电泳及成像
• 3.4.5 测序及分析
• 4 结果与分析
• 4.1 马铃薯早疫病菌的鉴定
• 4.1.1 病原菌的分离结果
• 4.1.2 病原菌致病性
• 4.1.3 病原菌形态特征
• 4.1.4 马铃薯早疫病菌rDNA ITS 的PCR 扩增和序列分析
• 4.2 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的敏感性及敏感基线
• 4.2.1 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲的敏感性及敏感基线
• 4.2.2 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对咯菌腈的敏感性及敏感基线
• 4.3 马铃薯早疫病菌（ A. alternata） 对异菌脲抗性突变体的诱导及其生物学 特性
• 4.3.1 抗性突变体的获得及其对异菌脲的抗性水平
• 4.3.2 抗性遗传稳定性
• 4.3.3 抗性突变体及其亲本敏感菌株生物学特性
• 4.3.4 交互抗性
• 4.3.5 抗性突变体及其亲本敏感菌株对NaCl 渗透压的敏感性
• 4.3.6 抗性突变体及其亲本敏感菌株菌丝的细胞膜透性
• 4.4 马铃薯早疫病菌（ A. alternata） 对咯菌腈抗性突变体的诱导及其生物学特性
• 4.4.1 抗性突变体的获得及抗性水平
• 4.4.2 抗性遗传稳定性
• 4.4.3 抗性突变体及其亲本敏感菌株生物学特性
• 4.4.4 交互抗性
• 4.4.5 抗性突变体及其亲本敏感菌株对NaCl 渗透压的敏感性
• 4.4.6 抗性突变体及其亲本敏感菌株细胞膜透性
• 4.5 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性分子机制
• 4.5.1 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲的抗性分子机制
• 4.5.2 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对咯菌腈的抗性分子机制
• 5 讨论
• 5.1 马铃薯早疫病病原菌鉴定
• 5.2 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的敏感性
• 5.3 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性突变体的诱导及其生物学特性
• 5.4 马铃薯早疫病菌（A. alternata）对异菌脲和咯菌腈的抗性分子机制
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 读研期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢