转染反义c-erbB-2 mRNA对子宫内膜癌ISHIKAWA及HEC-1A细胞株生长抑制作用的研究

论文摘要

基因的突变及过渡表达导致的癌基因激活是多数肿瘤发病的重要因素。由于mRNA较DNA更易有效地进行操控,因而通过阻断基因的蛋白合成来有效地抑制相关基因就成为最近研究的热点。目前,通过阻断已发生突变或过渡表达基因mRNA的方法在治疗肿瘤、心血管性疾病及病毒性疾病等的研究中已有大量的报。反义技术具有选择性高、对靶目标亲和力强、生效快速、机制确切、易于操控及副作用少等特点,从而使其成为目前有效地抑制相关基因的常用的方法,并且在乳腺癌及卵巢癌等肿瘤的研究中已取得了可喜的成果。然而,在子宫内膜癌的研究中还未见相应的报道。已知c-erbB-2（HER-2/neu）是子宫内膜癌主要的原癌基因,在内膜癌的生物学行为中起着重要的作用,其过度表达是内膜癌预后不良的重要因素。因而,本研究的目的即为评价转染c-erbB-2反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides,ASODNs）对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞株及中分化子宫内膜癌HEC-1A细胞株生长抑制作用的效果。方法1.C-erbB-2在子宫内膜癌中的表达以及与内膜癌临床病理因素之间的关系免疫组化:通过免疫组化S-P方法检测C-erbB-2蛋白在10例子宫内膜不典型增生及31例不同期别、不同组织分级、不同肌层浸润深度的子宫内膜癌组织中的表达,分析其表达强度与子宫内膜癌临床及病理因素之间的关系。2.转染反义c-erbB-2 mRNA对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞株及中分化HEC-1A细胞株生长抑制作用的研究2.1细胞培养将ISHIKAWA及HEC-1A细胞培养于含10%胎牛血清（Gibco）及50μg/ml青霉素和链霉素的DMEM（Gibco）培养基中。孵箱温度为37℃,CO2浓度为10%,每周传代2次。培养细胞用于各项实验研究。2.2免疫组化ISHIKAWA及HEC-1A细胞培养于盖玻片48h,待玻片细胞融合率达75%以上后,采用S-P法免疫组化检测c-erbB-2蛋白在细胞膜上的表达情况。2.3 C-erbB-2 ASODNs转染ISHIKAWA及HEC-1A细胞上述培养细胞于对数生长期,经0.25%胰酶消化后加入DMEM培养基制成单细胞悬液。计数后,接种于96孔板,每孔接种5×103个细胞加100ulDMEM培养基,培养48h,待细胞融合率达90%以上时进行转染。转染试剂为Lipofectamine2000。2.4透射电镜观察各组细胞超微结构的变化两种培养细胞于对数生长期经0.25%胰酶消化后,DMEM培养液制成单细胞悬液,接种于A、B、C、D、E及a、b、c、d、e、10个培养瓶内（75cm2）,每瓶接种细胞数为1×107,加20ml DMEM培养液,培养48h。待融合率达90%以上后,吸净培养液,5ml DM液轻轻冲洗细胞表面2次。A/a瓶内加入10 ml DM液,作为正常对照。B/b、C/c、D/d瓶分别加入10ml DM液稀释的浓度为0.3uM的ASODNs/lipofectamine2000转染液、ASODNs对照液、SODNs/lipofectamine2000转染液,E/e瓶加入10 ml相应浓度的Iipofectamine2000对照液。培养24h后,每瓶再加入10ml含10%胎牛血清及抗生素的DMEM培养液,继续培养48h。收集细胞行透射电镜检测。2.5流式细胞仪检测细胞凋亡将两种细胞接种于6孔板的5个孔内,标记为A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1。每孔细胞密度为1×106。A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1分别为正常对照,ASODNs转染,ASODNs对照,SODNs转染,及lipofeetamine2000对照。转染浓度为0.3uM。转染后收集细胞经流式细胞仪检测细胞凋亡。2.6 RT-PCR assay细胞培养、转染及细胞收集同流式细胞术步骤,每一标本含1×106个细胞。转染细胞消化、收集、洗涤、沉淀后以Trizol（Invitrogen）试剂提取各标本总RNA（详见试剂操作说明）。采用TaKaRa试剂盒（AMV,TaKaRa Bio.,Japan）行RT-PCR检测c-erbB-2 mRNA表达变化情况。2.7 western blot分析细胞培养、转染、收集及洗涤同电镜步骤。每一标本1×107细胞。转染后的细胞行western blot检测c-erbB-2蛋白表达的变化。结果1.C-erbB-2在子宫内膜癌中的表达以及与内膜癌临床病理因素之间的关系1.1 c-erbB-2在子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌组织中的表达c-erbB-2在子宫内膜非典型增生及内膜癌组织中的阳性表达率分别为40%及58%,二者的差异无统计学意义（P＞0.05）。1.2子宫内膜癌中c-erbB-2的表达与临床、病理因素的相关性c-erbB-2在子宫内膜癌中阳性表达率与肿瘤的病理组织分级呈正相关（P＜0.05）,其阳性表达率随肿瘤病理分级的增高而增高。c-erbB-2的阳性表达率与患者的年龄、肿瘤浸润肌层深度、激素受体状态（ER、PR）、淋巴结有无转移、临床手术-病理分期无相关性（P＞0.05）。2、转染反义c-erbB-2 mRNA对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞株生长的抑制作用2.1免疫组化c-erbB-2蛋白在ISHIKAWA及HEC-1A细胞膜上呈阳性表达。2.2转染c-erbB-2 ASODNs后光镜下细胞形态的变化随着转染ASODNs浓度由0.1uM-0.6uM逐渐增加,两种细胞均逐渐呈现皱缩、破坏甚至崩解。而未加转染试剂单纯用0.6uM ASODNs处理的细胞、0.6uM SODNs转染的细胞以及单纯用转染0.6uM ASODNs所需浓度的Lipofectamine2000处理的细胞其光镜下形态学变化与正常对照细胞差异不大。2.3转染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后电镜下细胞超微结构的变化转染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后ISHIKAWA及HEC-1A细胞浆内均发生明显空泡变性、细胞器消失、胞核明显皱缩、结构消失。未加转染试剂单纯用0.3uM ASODNs处理的细胞其胞浆内仅出现轻度的空泡变性,细胞器存在,细胞核结构清晰。而转染0.3uM SODNs的细胞及单纯用转染0.3uM ASODNs所需浓度的Lipofectamine2000处理的细胞其超微结构与正常对照细胞相比无明显变化。2.4转染0.1uM-0.6uM c-erbB-2 ASODNs后MTT检测细胞生长抑制情况随着ASODNs转染浓度的增加,两种细胞生长抑制强度逐渐加强。而SODNs转染组及单纯用Lipofectamine2000处理组,随着浓度的增加细胞生长抑制性表现不明显。2.5流式细胞术检测各组细胞凋亡率用0.3uM ASODNs转染两种细胞后,其凋亡率较其它组明显升高。2.6 RT-PCR及Western blot分析转染0.3uM ASODNs的两种细胞,其c-erbB-2 mRNA及蛋白表达量较其它组明显降低。结论1.c-erbB-2在子宫内膜癌中阳性表达率与肿瘤的病理组织分级呈正相关关系。2.随着转染ASODNs浓度由0.1uM-0.6uM逐渐增加,ISHIKAWA及HEC-1A两种细胞光镜下形态及电镜下超微结构的破坏逐渐加重。3.转染ASODNs可抑制c-erbB-2 mRNA及其蛋白在ISHIKAWA及HEC-1A细胞中的表达。4.转染ASODNs可导致ISHIKAWA及HEC-1A细胞凋亡。5.随着ASODNs转染浓度的增加,两种细胞生长抑制强度逐渐加强。

论文目录

• 一、摘要
• 1.中文论著摘要
• 2.英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 c-erbB-2的表达与内膜癌临床及病理因素的关系
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 论文二 转染反义c-erbB-2 mRNA对高分化子宫内膜癌ISHIKAWA细胞株生长抑制的研究
• 1.前言
• 2.方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 论文三 反义c-erbB-2寡核苷酸对中分化子宫内膜癌HEC-1A细胞株生长抑制的作用
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 3.结果（附论文图片）
• 4.讨论
• 5.结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 1.综述
• 2.在学期间科研成绩
• 3.致谢
• 4.个人简介