朝鲜鹌鹑MC1R基因克隆及其在不同羽色个体中表达水平的研究

论文摘要

鹌鹑的羽色遗传与30多个基因座有关，羽色表型和基因型之间存在着复杂的关系。野灰信号蛋白（ASIP）基因、溶解携带45家族2号成员蛋白（SLC45A2）基因、酪氨酸关联蛋白1（TYRP1）基因、黑色素皮质激素受体1（MC1R）基因、内皮质体（EDNRB2）基因是鹌鹑羽色的候选基因，这些基因的表达产物都参与或调控了黑色素合成及运输过程。黑素皮质素受体l（MC1R）由毛色扩展位点编码而成，对动物体色的形成起着重要的作用。本研究通过混合样品DNA测序方法寻找MC1R基因的突变位点，采用PCR-SSCP以及A1u1-RFLP的方法对突变位点在4种羽色鹌鹑（栗羽、黄羽、白羽、黑羽）群体中的分布进行了研究，揭示MC1R基因与鹌鹑羽色性状之间的关系。试验表明，运用DNA测序的方法在鹌鹑MC1R基因上发现2个突变位点：一个A/G突变位点，导致编码蛋白发生IIe58Val突变（该位点采用PCR-SSCP分析）；另一个突变位点是C/T突变，但是没有导致编码蛋白改变（该位点采用PCR-RFLP分析）。最终发现A/G突变位点在4种羽色鹌鹑群体间没有显著差异（P>0.05），C/T突变位点在4种羽色鹌鹑群体间有显著差异（P<0.05）。本研究没有发现导致日本鹌鹑黑羽突变的Glu92Lys突变位点，表明朝鲜鹌鹑的黑羽突变与报道的日本鹌鹑黑羽突变的机制不同，朝鲜鹌鹑的黑羽可能与其它基因的突变有关。本试验克隆出朝鲜鹌鹑MC1R基因，全长测序结果经生物软件拼接后，得到朝鲜鹌鹑MC1R基因编码区为942bp大小的片段，只有个1外显子，编码314个氨基酸。经用BLAST对比，发现此片段与Genbank上公布的鹌鹑的MC1R基因序列同源性较高，高达98%。以四种羽色朝鲜鹌鹑的DNA作为模板，PCR反应后用SeqMan程序和Chromas软件分析发现，在四种羽色鹌鹑的MC1R基因的外显子212bp位置处有1个SNP（A-212-G），在577bp位置处发现第2个SNP（C-577-T），只有栗羽没有明显的变异位点，其他3种羽色均发生明显的突变位点。利用qRT-PCR技术测定了MC1R基因在12日龄四种羽色鹌鹑胚胎的皮肤组织中的表达情况。结果表明，四种羽色鹌鹑皮肤组织中MC1R基因的表达量存在明显差异，栗羽鹌鹑皮肤组织中该基因的表达量明显高于黑羽鹌鹑皮肤中的表达量，该基因在四种羽色鹌鹑皮肤组织中表达的高低次序为：栗羽>黄羽≧白羽>黑羽，表明MC1R基因与鹌鹑羽色变异的关系复杂。对栗羽和黑羽鹌鹑MClR氨基酸序列进行了蛋白结构预测。栗羽鹌鹑的MClR蛋白中形成7个α-螺旋，其中有跨膜α-螺旋3个，10个β-折叠。黑羽鹌鹑MClR蛋白结构由于氨基酸的组成和序列发生改变，导致其蛋白质的构象发生改变，可能影响其功能。突变型MClR蛋白结构中只形成5个α-螺旋，5个β-折叠，其中有3个跨膜α-螺旋。按照Kyte-Doolittle的氨基酸亲水标准，可知栗羽鹌鹑的MClR蛋白的亲水区（≥0）是5-12，26-33，112-127，142-163，214-236和302-312区段氨基酸。黑羽鹌鹑MClR亲水区（≥0）是5-12，26-33，85-89，93-101，165-170和230-235区段氨基酸。依据Emini原则，得到栗羽鹌鹑MClR氨基酸表面暴露区为7-10，26-30，112-124，和218-229区，可能位于蛋白质表面的区域为142-162和218-229区。依据氨基酸带电情况，预测在多肽链上，氨基酸为正电荷区为7-11，28-32，112-127，138-157，159-168，185-189，209-238，255-259，267-271和300-311区段的；氨基酸为负电荷区13-17，52-56，75-78，91-95，103-108，和288-296区段；黑羽鹌鹑MClR表面的暴露区为7-10，26-30，112-124，142-162和218-229区段氨基酸，其中最有可能位于蛋白质表面的区域为142-162和218-229区段氨基酸。根据氨基酸带电情形，预测在多肽链上氨基酸为正电荷区7-10，27-31，108-113，145-157区段；氨基酸为负电荷区13-17，32-43，52-56，75-85，86-90，99-103和157-165区段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 鹌鹑的羽色形成机制
• 1.2 鹌鹑羽色遗传研究
• 1.2.1 鹌鹑羽色类型
• 1.2.2 朝鲜鹌鹑羽色的遗传
• 1.3 几个主要候选基因与鹌鹑羽色变化
• 1.3.1 ASIP 基因突变与鹌鹑羽色变化
• 1.3.2 SLC45A2 基因突变与鹌鹑羽色变化
• 1.3.3 MITF 与羽（肤）色的变化
• 1.3.4 EDNRB2 突变与熊猫色
• 1.3.5 TYRP 基因突变与鹌鹑羽色的变化
• 1.3.6 MC1R 基因突变与鹌鹑羽色变化
• 1.4 测试羽色基因的实验技术
• 1.4.1 DNA 分子标记
• 1.4.2 cDNA 的克隆和测序
• 1.4.3 实时荧光定量
• 1.4.4 生物学信息分析法
• 1.5 研究的意义
• 第2章 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要仪器设备与试剂
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 引物溶液的配制和稀释
• 2.1.5 DNA 溶液的稀释
• 2.1.6 主要试剂和溶液配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 DNA 和 RNA 提取方法
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA
• 2.2.3 DNA 的纯化
• 2.2.4 本试验涉及到的 PCR 技术
• 2.2.5 反应程序与体系
• 2.2.6 PCR 反应产物的电泳
• 2.2.7 PCR 扩增产物的检测及测序分析
• 2.2.8 PCR-RFLP 分析
• 2.2.9 qRT-PCR 分析
• 2.2.10 数据统计分析
• 2.2.11 鹌鹑 PCR 产物的纯化、测序及 SNP 多态性位点筛选
• 2.2.12 生物信息学分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 朝鲜鹌鹑 MC1R 基因多态性的研究
• 3.1.1 MC1R 基因第 1 外显子 212bp 处的 A/G 突变位点的分析
• 3.1.2 MC1R 基因第 1 外显子 577bp 处的 C/T 突变位点的分析
• 3.2 朝鲜鹌鹑 MC1R 实时定量分析
• 3.3 朝鲜鹌鹑 MC1R 基因的生物学信息分析
• 第4章 讨论
• 4.1 MC1R 基因多态性
• 4.2 qRT–PCR 定量分析
• 4.3 关于生物学信息
• 4.4 关于 SSCP-PCR 和 A1u1-RFLP 方法
• 第5章 结论
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果