植物次生物质对棉铃虫细胞色素P450s的诱导及CYP6B6基因的克隆与表达

论文题目: 植物次生物质对棉铃虫细胞色素P450s的诱导及CYP6B6基因的克隆与表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 农业昆虫与害虫防治

作者: 刘小宁

导师: 高希武

关键词: 棉铃虫,细胞色素,十三烷酮,槲皮素,单宁酸,诱导,基因克隆,原核表达

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文以棉铃虫Heficoverpa armigera（Hubner）为对象,研究了槲皮素、2-十三烷酮、单宁酸等植物次生物质组合诱导对棉铃虫细胞色素P450s含量和活性的影响。明确了槲皮素和2-十三烷酮对棉铃虫P450s活性诱导的时间效应和剂量效应、槲皮素对棉铃虫不同组织总mRNA含量的影响以及植物次生物质对CYP686基因表达量的影响。对棉铃虫P450 CYP686基因进行了克隆和序列分析,并在原核细胞中进行了表达。 采用饲料添加法,用2-十三烷酮和槲皮素处理棉铃虫6龄幼虫48h后,两种植物次生物质对中肠P450s含量诱导具有累加效应,而对脂肪体P450s含量诱导表现为累加或拮抗作用。 利用毛细管气相色谱法灵敏度高,样品用量少,分辨率高的特点,建立了一个用于检测棉铃虫幼虫中肠和脂肪体细胞色素P450s O-脱甲基活性的小型反应体系（875μL）,其中含0.1 mol/L,pH 7.8的Tris-HCl缓冲溶液,0.5μmol NADPH,7.5μmol MgCl2,0.085% BSA,0.157mmol对硝基苯甲醚及2.08mg/mL酶液。 槲皮素和2-十三烷酮对棉铃虫中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性具有明显的诱导作用。组合诱导也得到相似的结果。当两种植物次生物质浓度为0.5 mg/mL时,对中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性诱导倍数均达到最大,分别为2.63和3.88倍。虽然两种植物次生物质对活性的诱导不存在互作增效关系,但是随浓度增加其活性有增加的趋势。 诱导的时间和剂量效应表明,当槲皮紊浓度为0.1 mg/mL时,中肠利脂肪体P450s的诱导活性随时间是先降低后增强,到48h达到最大（分别为对照的2.03倍和2.4倍）,然后降低到正常水平;而槲皮素浓度为0.5 mg/mL时,诱导活性仅有一个高峰,发生在48 h,诱导倍数分别是2.8和2.79。2-十三烷酮对P450s诱导效应与槲皮素不同,2-十三烷酮对脂肪体P450s活性诱导与对照相比从4-48 h均为诱导增强,48 h后表现为诱导抑制。除2-十三烷酮浓度为0.1 mg/mL,处理时间为4 h和36 h时对中肠P450s活性为诱导增加之外,其余各处理时间点的活性和对照相比差异不显著。 研究了槲皮素对棉铃虫中肠利脂肪体总mRNA比含量影响的时间效应,结果表明在处理5 h、24 h和36 h时,槲皮素对中肠总mRNA含量具有明显的诱导增加作用。脂肪体总mRNA的量诱导组与对照相比没有显著差异。 用半定量RT-PCR检测植物次生物质对CYP686基因表达的影响,表明槲皮素对中肠和脂肪体的CYP686基因的表达量、单宁酸对脂肪体CYP686基因表达量没有明显的诱导作用。单宁酸对中肠CYP686基因的表达量具有明显的诱导作用。2-十三烷酮对中肠和脂肪体两个组织部位的CYP686基因表达量均具有明显的诱导作用。 依据已发表的棉铃虫CYP686基因设计2对引物,用RT-PCR的方法从棉铃虫中肠和脂肪体中分别克隆出P450的全长基因,生物信息学分析结果表明该基因为CYP686基因（注册号 AY950636和AY950637）。

论文目录:

第一章 绪论

1.1 细胞色素P450的分类及一般特性

1.1.1 细胞色素P450的命名及其分类

1.1.2 细胞色素P450的进化

1.1.3 细胞色素P450的结构特征

1.1.4 细胞色素P450的光谱特征

1.1.5 细胞色素P450的多样性

1.1.5.1 细胞色素P450种类的多样性

1.1.5.2 细胞色素P450分布、表达的多样性

1.1.5.3 P450催化反应及功能的多样性

1.2 植物次生物质对昆虫细胞色素P450诱导的研究

1.2.1 植物次生物质对昆虫细胞色素P450诱导的一些特征

1.2.1.1 诱导的时间和剂量效应

1.2.1.2 诱导的特异性和重叠性

1.2.1.3 诱导的适应性意义

1.2.2 诱导机制

1.3 细胞色素P450、植物次生物质与抗药性的关系

1.3.1 细胞色素P450与抗药性

1.3.2 P450介导的昆虫抗药性的分子基础

1.3.3 植物次生物质诱导的P450与抗药性的关系

1.4 本文研究意义

第二章 2-十三烷酮和槲皮素对棉铃虫P450s的诱导

2.1 棉铃虫细胞色素P450s 0-脱甲基活性的测定

2.1.1 材料与方法

2.1.1.1 试剂

2.1.1.2 主要仪器

2.1.1.3 酶液制备

2.1.1.4 细胞色素P450s 0-脱甲基活性测定

2.1.1.5 气相色谱检测条件

2.1.1.6 蛋白质含量的测定

2.1.1.7 细胞色素P450s 0-脱甲基活性的计算

2.1.2 结果与分析

2.1.2.1 气相色谱法检测对硝基苯酚

2.1.2.2 酶量和温度对细胞色素P450s 0-脱甲基活性的影响

2.1.2.2.1 酶量对细胞色素P450s 0-脱甲基活性的影响

2.1.2.2.2 温度对细胞色素P450s 0-脱甲基活性的影响

2.1.3 讨论

2.2 2-十三烷酮和槲皮素诱导对棉铃虫P450s 0-脱甲基活性的影响

2.2.1 材料与方法

2.2.1.1 试剂

2.2.1.2 主要仪器

2.2.1.3 试虫饲养与处理

2.2.1.4 酶液制备

2.2.1.5 细胞色素P450s 0-脱甲基活性测定

2.2.1.6 气相色谱检测条件

2.2.1.7 蛋白质含量的测定

2.2.1.8 细胞色素P450s 0-脱甲基活性计算

2.2.2 结果

2.2.2.1 2-十三烷酮和槲皮素对棉铃虫中肠细胞色素P450s 0-脱甲基活性的影响

2.2.2.2 2-十三烷酮和槲皮素对棉铃虫脂肪体细胞色素P450s 0-脱甲基活性的影响

2.2.3 讨论

2.3 棉铃虫P450s活性诱导的时间和剂量效应

2.3.1 材料与方法

2.3.1.1 试剂

2.3.1.2 主要仪器

2.3.1.3 试虫饲养与处理

2.3.1.4 酶液制备

2.3.1.5 细胞色素P450s 0-脱甲基活性测定

2.3.1.6 气相色谱检测条件

2.3.1.7 蛋白质含量的测定

2.3.1.8 细胞色素P450s 0-脱甲基活性计算

2.3.2 结果

2.3.2.1 槲皮素对棉铃虫中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性诱导的时间和剂量效应

2.3.2.2 2-十三烷酮对棉铃虫中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性诱导的时间和剂量效应

2.3.3 讨论

2.4 2-十三烷酮和槲皮素诱导对棉铃虫P450s含量的影响

2.4.1 材料与方法

2.4.1.1 供试昆虫及其处理

2.4.1.2 化学试剂

2.4.1.3 主要仪器

2.4.1.4 酶液制备

2.4.1.5 蛋白质含量的测定

2.4.1.6 细胞色素P450s含量的测定

2.4.2 结果与分析

2.4.2.1 2-十三烷酮和槲皮素诱导对棉铃虫脂肪体细胞色素P450s比含量的影响

2.4.2.2 2-十三烷酮和槲皮素诱导对棉铃虫中肠细胞色素P450s比含量的影响

2.4.3 讨论

第三章 槲皮素对棉铃虫总RNA和mRNA的影响

3.1 材料和方法

3.1.1 供试虫源

3.1.2 化学试剂

3.1.3 总RNA的提取和纯化

3.1.4 反转录

3.2 结果

3.2.1 槲皮素对棉铃虫中肠和脂肪体总RNA比含量影响的时间效应

3.2.2 槲皮素对棉铃虫中肠和脂肪体cDNA比含量影响的时间效应

3.3 讨论

第四章 棉铃虫P450基因的克隆

4.1 棉铃虫P450基因5’端基因的克隆

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.1.3 结果与分析

4.2 棉铃虫P450基因3’端基因的克隆

4.2.1 材料与方法

4.2.2 结果与分析

4.3 2-十三烷酮诱导的P450全长基因的克隆

4.3.1 材料与方法

4.3.2 结果与分析

4.4 讨论

第五章 植物次生物质诱导对棉铃虫CYP6B6基因表达的影响

5.1 材料和方法

5.1.1 供试虫源

5.1.2 化学试剂

5.1.3 总RNA的提取和cDNA合成

5.1.4 引物设计

5.1.5 CYP6B6基因mRNA相对表达量的测定

5.2 结果

5.2.1 最适模板量的选择

5.2.2 最适循环数的选择

5.2.3 2-十三烷酮和槲皮素组合诱导对棉铃虫中肠CYP6B6基因表达的影响

5.2.4 2-十三烷酮和槲皮素组合诱导对棉铃虫脂肪体CYP6B6基因表达的影响

5.2.5 单宁酸诱导对棉铃虫CYP6B6基因表达的影响

5.3 讨论

第六章 棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6基因的外源表达

6.1 材料

6.1.1 菌种和质粒

6.1.2 主要化学试剂

6.1.3 引物设计

6.1.4 部分储存液配方

6.2 方法

6.2.1 P450基因原核表达载体的构建

6.2.2 重组表达质粒PGEXF／G的构建和双酶切鉴定

6.2.2.1 质粒PGEX-4T-1双酶切以及回收

6.2.2.2 PCR扩增F／G全长，使其带上BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点

6.2.2.3 目的基因和表达载体的连接

6.2.2.4 连接产物的转化、鉴定

6.2.3 细胞培养和诱导表达

6.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

6.2.5 细胞色素P450s含量测定

6.2.6 蛋白的含量测定

6.3 结果

6.3.1 质粒PGEX-4T-1双酶切以及回收

6.3.2 带BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的CYP6B6基因的扩增

6.3.3 连接产物的转化、鉴定

6.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析

6.3.5 细胞色素P450s的比含量测定

6.4 讨论

6.4.1 表达系统和表达载体的选择

6.4.2 融合蛋白产量的提高

6.4.3 表达的结果

6.4.4 展望

第七章 总结

7.1 总结

7.2 本研究的创新之处

7.3 问题和展望

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-18

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