siRNA沉默TRAF6基因对食管癌EC109细胞增殖及凋亡的影响

论文摘要

背景和目的:食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国恶性肿瘤中居第四位。近年来大量统计资料表明,我国的食管癌发病率和死亡率呈逐年升高的趋势。食管癌的发生发展非单个分子事件,而是一个多因素、多阶段、长时间的多步骤过程,涉及多个癌基因和抑癌基因的改变以及细胞调控机制的异常。某些信号转导通路如NF-κB信号转导通路的持续激活及对细胞的异常调节,在人类食管肿瘤的发生发展过程中也起着很重要的作用。核因子κB （NF-κB）是一种重要的转录因子,参与多种基因的调控。NF-κB可以调节凋亡相关基因,原癌基因,以及肿瘤相关黏附分子等。而这些基因与肿瘤的发生、转化、浸润以及转移密切相关。活化的NF-κB存在于很多人类肿瘤中如非何杰金氏淋巴瘤,前列腺癌以及头颈部鳞癌等,并在这些肿瘤的发生发展中起着重要的作用。肿瘤坏死因子受体相关蛋白6 （TRAF6）是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族和白细胞介素-1受体/Toll样受体（IL-1K/TLR）超家族重要信号转导分子,是一种能够激活NF-κB信号通路的重要因子。RNA干扰（RNAi）是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录、转录后和翻译水平上阻断基因的表达。本研究旨在应用RNAi技术,探讨TRAF6基因在食管癌发生演进过程中的作用及可能机制。材料和方法:1.食管鳞癌细胞系EC109用DMEM + F12培养基在六孔板中进行培养至细胞生长达40%-70%后,进行TRAF6 siRNA及Negative Control siRNA的转染;2.转染24h后倒置显微镜观察细胞形态,RNAiso Reagent提取细胞总RNA,RT-PCR检测TRAF6基因的干扰效果;3.转染24h后,收集贴壁细胞,PBS清洗、离心、试剂盒分级提取可溶性亚细胞组分蛋白,Westen Blot分析TRAF6和P65两种蛋白在EC109细胞中的表达;4.收集转染24h的细胞,PBS清洗,离心,4%多聚甲醛固定后,加入细胞通透剂,分别加入一抗,FITC标记二抗,孵育后流式细胞术检测TRAF6蛋白荧光强度;5.细胞转染24h后,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测各组细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线。收集转染后十二孔板中各组细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡的变化情况;6.实验数据用SPSS13.0统计软件进行分析处理。结果:1.筛选出TRAF6有效的siRNA片段及浓度,优化了RNAi实验条件;2. RT-PCR,免疫印迹分析及流式检测结果显示TRAF6基因得到有效的干扰;3. TRAF6基因干扰后,免疫印迹分析显示EC109细胞核内P65蛋白表达降低;4. TRAF6基因干扰前后EC109细胞的形态学没有显著差别;EC109细胞在TRAF6基因干扰前后的增殖没有差异;而TRAF6干扰后,肿瘤细胞凋亡增多。结论:TRAF6基因在食管癌的发生发展中起着重要的作用,其主要的作用机制可能参与NF-κB途径的过度激活而抑制EC109细胞的凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 材料与方法
• 1 常用试剂、仪器和溶液
• 2 实验材料及准备
• 3 siRNA 转染
• 4 反转录聚合酶链反应
• 5 流式细胞术检测 TRAF6 蛋白
• 6 免疫印迹分析
• 7 MTT 检测细胞增殖
• 8 细胞凋亡检测
• 9 统计学分析
• 结果
• 1 siRNA 干扰序列的效率及浓度检测
• 2 TRAF6 基因干扰效果的检测
• 3 NF-κB P65 蛋白的表达检测
• 4 TRAF6 基因干扰前后食管癌细胞的形态学观察
• 5 TRAF6 基因对 EC109 细胞凋亡的影响
• 6 TRAF6 基因对 EC109 细胞增殖的影响
• 讨论
• 1 RNAi 及 siRNA 序列的筛选
• 2 TRAF6 基因对 EC109 细胞形态学、增殖和凋亡的影响
• 3 TRAF6 基因功能的进一步研究
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介及论文发表情况