破骨细胞完善体外类骨组织重建的探索性研究

论文摘要

近来，越来越多的证据明确表明了破骨细胞的调节作用对于正常的骨形成是至关重要的。破骨细胞缺乏动物所表现出来的骨形成异常在目前的组织工程化骨中也都有所反映。因此，破骨细胞参与到骨体外重建策略中来不仅能洞察移植后骨重塑以及成骨细胞和破骨细胞相互作用，而且也能为完善组织工程化骨提供必要的解决办法。本研究主要探索既符合生理过程又实际有效的破骨细胞引入途径。目的：1)获取破骨细胞前体（融合前破骨细胞，pOCs）并描述其生物学特征；2)实验分析成骨细胞的分化程度与pOCs成熟的关系；3)建立创新的破骨细胞在组织工程化骨生成方法；4)观察破骨细胞的生成，功能表达，以及对支架类骨结构的影响。方法：2个月昆明鼠全骨髓细胞与新生鼠原代颅骨成骨细胞共同培养在含有1，25（OH）2D3的培养液中6天。通过轻轻吹打新加的介质，打下黏附不紧密的细胞作为pOCs使用。当这种细胞悬液接种于培养板，半小时后经抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和碱性磷酸酶（ALP）染色，确定pOCs的存在和数目以及有无多核细胞和成骨细胞的混杂。TRAP荧光染色进一步对结果进行确认。通过融合试验来研究原代成骨细胞对pOCs融合的影响。为了研究成骨细胞分化程度与pOCs成熟的关系，成骨细胞系MC3T3-El细胞被接种到培养板，使用成骨介质培养到细胞汇聚（4d）、矿化开始（16d）和高度矿化（28d），矿化是通过茜素红染色来判定。这三种培养物分别代表骨形成过程中细胞增殖、基质沉积和成熟以及基质矿化。pOCs分别接种到三种培养物，在生长介质中共培养3d。然后进行TRAP染色确定类破骨细胞的形成；纤维肌动蛋白（F-actin）荧光染色判断其吸收活性。在建立破骨细胞符合生理过程引入实验中，MC3T3-El细胞首先接种于支架上，在成骨介质中培养5w和12w，接着pOCs分别接种到低矿化（5w）和高矿化（12w）支架结构上，在生长介质中培养3d和8d。支架的矿化程度通过支架上磷含量检测来判定。然后进行无任何处理的环境扫描电镜（ESEM）和一般电镜检测（SEM），观察类破骨细胞的形成和功能表达；支架切片F-actin荧光染色判断其吸收活性。结果：在pOCs制备物中，没发现多核细胞和ALP阳性的成骨细胞，TRAP阳性细胞约占接种细胞总数的60％。融合试验表明成骨细胞的存在对于pOCs融合是必不可少的。在分析成骨细胞分化与pOCs成熟关系实验中，在高度矿化培养物中，可见到大小不等的矿化结节。结节的矿化程度可用透光度来表示。这些结节，依其透光度，可分为带有黑色纹理的不充分矿化结节、除边缘以外全黑的相对充分矿化结节和全黑的充分矿化结节。TRAP染色后，在增殖期和刚矿化共培养物中，TRAP阳性细胞分散存在，没发现大于两个核的TRAP阳性细胞。在高度矿化共培养物中，可见到TRAP阳性细胞聚集在为数很少的大的不充分和相对充分矿化结节周围。约95％大于两个核TRAP阳性细胞在这样的细胞中存在。这表明pOCs的成熟不仅与基质的矿化有关也与矿化量有关。聚集在相对充分矿化结节周围的TRAP阳性细胞有向其集中的趋势。大的充分矿化结节周围无明显细胞聚集现象；但一些原本不透光的结节却有不同程度的TRAP染色。这种TRAP染色结节说明矿物有吸收；间接反映了所形成的类破骨细胞有骨吸收活性。细胞在大矿化结节周围分布的差异反映了在大小类似的情况下，结节矿化程度越高，对周围的TRAP阳性细胞的趋化能力越强。F-actin荧光染色显示了在大矿化节结上F-actin环的出现，这是破骨细胞具有吸收活性的特征标志，直接证明了所形成的类破骨细胞具有骨吸收活性。在研究破骨细胞生理引入实验中，通过ESEM和SEM观察到各种形态的类破骨细胞生成。在高度矿化支架结构上（12周），类破骨细胞更容易发现并且尺寸更大；这可能是类破骨细胞的形成与骨基质功能状态相适应的反映。而且使用ESEM观察到正在吸收的类破骨细胞，这个细胞展示了面向骨面的细胞膜特化结构—皱褶缘和封闭区及其足体，同时吸收坑也清晰可见。这无疑表明使用这一策略产生的类破骨细胞能够吸收由成骨细胞在体外产生的类骨基质。支架切片F-actin荧光染色显示了F-actin环的出现，进一步确认类破骨细胞的吸收活性。在原本总是被成骨细胞异常生长所形成的膜状或条索状结构占据的支架孔壁上，出现巨大的细胞融合体。在类破骨细胞出现的地方，观察不到明显的成骨细胞异常生长结构。这些现象表明类破骨细胞能以某种方式去除异常细胞结构。结论：1)通过机械分离从破骨细胞分化培养物中获取pOCs是一种简单、有效的获取破骨细胞来源细胞的方法。2)在模拟骨组织发育和形成过程中，pOCs的成熟需要骨基质的形成和累积。3)由pOCs在细胞矿化支架结构上生成破骨细胞是生理、有效、可行的破骨细胞引入方法。4)破骨细胞的引入可以起到改善组织工程化骨结构的作用。

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第一章绪论

一骨生物学概述

1. 骨的功能

2. 骨组织的类型

3. 骨的组成

3.1 基质组成

3.2 细胞组成

3.3 骨表面

4. 骨结构改变的方式

4.1 骨生成

4.2 骨塑造

4.3 骨重塑

二、骨组织工程的研究现状

1. 骨组织工程的产生和发展过程

2. 组织工程的定义

3. 骨组织工程治疗策略

4. 骨组织工程构成要素

5. 组织工程化骨构建中存在的问题

三、本研究课题的提出

参考文献

第二章破骨类细胞的获取和各种方法的比较

一破骨细胞前体（pOCs）的获取和生物学行状的研究

1. 本部分主要实验材料

2. 实验方法

2.1 颅骨原代成骨细胞的获取

2.2 骨髓细胞的获取

2.3 原代成骨细胞和骨髓细胞共培养制备pOCs

2.4 共培养的时间对pOCs获得数目的影响

2.5 pOCs融合试验

2.5.1 原代成骨细胞的存在和数目对pOCs融合的影响

2.5.2 pOCs的数目对pOCs融合的影响

2D₃对pOCs融合的影响'>2.5.3 促骨激素1a，25（OH）₂D₃对pOCs融合的影响

2.6 组织染色

2.6.1 抗酒石酸酸性磷酸酶细胞染色

2.6.2 碱性磷酸酶细胞染色

2.6.3 pOCs细胞荧光染色

2.7 统计学方法

3. 结果

3.1 pOCs的获取和特征描述

3.2 pOCs融合试验

二、真实破骨细胞和类破骨细胞的获取和纯化

2. 实验方法

2.1 原代成骨细胞和骨髓细胞共培养获取和纯化类破骨细胞

2.2 从新生小鼠长骨分离和纯化破骨细胞

3. 结果

3.1 类破骨细胞的纯化

3.2 真实破骨细胞的纯化

4. 讨论

5. 结论

参考文献

第三章成骨细胞分化对破骨细胞形成的影响

一成骨细胞分化对破骨细胞从头形成的影响

1. 本部分特有主要实验材料

2. 实验方法

2.1 骨髓细胞与不同分化程度的成骨细胞共培养

2.2 培养介质碱性磷酸酶活性检测

2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶细胞染色

2.4 统计学方法

3. 结果

3.1 成骨细胞分化确认

3.2 成骨细胞的分化程度对破骨细胞从头生成的影响

4. 讨论

5. 结论

二、成骨细胞分化对破骨细胞前体成熟的影响

2. 实验方法

2.1 pOCs与不同分化程度的成骨细胞共培养

2.2 茜素红矿化节结染色

2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶细胞染色

2.4 细胞纤维肌动蛋白荧光染色

2.5 矿化节结尺寸分布图的绘制

3. 结果

3.1 成骨细胞的分化过程

3.2 成骨细胞的分化程度对pOCs成熟的影响

4. 讨论

5. 结论

参考文献

第四章体外类骨组织的构建及其破骨细胞引入

一组织工程化骨的特征描述

1. 本部分特有主要实验材料

2. 实验方法

2.1 骨组织工程支架的制造

2.2 组织工程化骨的构建

2.3 支架上细胞数量检测

2.4 支架上的磷含量的检测

2.5 电镜检测

2.5.1 环境扫描电镜检测

2.5.2 扫描电镜检测

2.6 统计学方法

3. 结果

3.1 支架制造

3.2 支架上细胞数量的变化

3.3 支架上磷含量的变化

3.4 支架构造物电镜观察

4. 讨论

5. 结论

二、破骨细胞引入方法的建立和初步结果

2. 实验方法

2.1 pOCs与生物矿化支架构造物共培养

2.2 组织冷冻切片荧光染色

2.3 电镜检测

2.3.1 环境扫描电镜检测

2.3.2 扫描电镜检测

3. 结果

3.1 类破骨细胞的生成

3.2 类破骨细胞骨吸收和基质结构的改善

3.3 异常细胞结构的消失

4. 讨论

5. 结论

参考文献

综述

致谢

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