来源于维氏气单胞菌B565的两个几丁质降解酶基因的高效表达、性质研究及水产养殖应用

论文摘要

几丁质又称甲壳素，是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的直链状高分子生物多聚体。据报道称，海产品加工处理过程中产生的大量虾、蟹壳等废弃物约占其自身重量的75%以上，而这些废弃物干重的18-60%都是几丁质。这些几丁质经几丁质降解酶部分降解后产生的几丁寡糖类生物活性物质，是目前几丁质工业中的高附加值产品，具有广泛的应用价值。本研究室从天津水产养殖池塘底泥中筛选分离得到一株具有降解粘孢子虫几丁质壳瓣能力的细菌（Aeromonas veronii B565），目前已完成其全基因组测序工作，经分析基因组中存在5个几丁质酶基因和1个β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因。本实验首先克隆了一个几丁质酶基因chiB565，在毕赤酵母系统中进行了高效表达，纯化后测得酶活力为112.9U/mL，比活力高达557U/mg。底物特异性结果表明，ChiB565对胶体几丁质、虾壳粉、几丁质粉末及葡聚糖具有降解作用；其最适反应温度为50°C，该温度下处理120min后仍有90%以上的酶活，温度稳定性较好；最适pH值为5.0，在pH5.0-9.0保持80%以上的相对酶活性；同时该酶对多种金属离子及中性蛋白酶具有良好的抗性。这些性质表明ChiB565基本符合水产养殖环境条件，因此进行了体外降解虾壳粉的实验，结果显示降解0.1g虾壳粉所需的最适反应时间为3h，最适反应酶量为30U,同时该酶与胰蛋白酶共作用时可以显著提高酪氨酸的释放量。基于以上结果，设计了以该酶为饲料添加剂的35天水产养殖饲喂罗非鱼实验，结果显示低浓度的添加量（16.2U/kg饲料）可以显著提高罗非鱼的体重，增重率（1015.09%±3.50）显著高于对照组（893.44%±30.58），并有效地降低了饲料转化系数，提高了饲料利用率；利用real-time PCR检测了HSP70和IL-1β的表达水平变化，结果显示饲料中添加低浓度的ChiB565时，HSP70表达量显著下调，即显著降低了罗非鱼的应激性，对鱼体安全无刺激；同时IL-1β的表达量也显著下调，即显著降低了鱼体的基础炎症反应；经过35天饲喂实验后进行嗜水气单胞菌攻毒实验显示低浓度下该酶可以明显地提高鱼体对病原菌的免疫保护率。因此该酶被认为是潜在的可以作为水产养殖饲料添加剂的饲用酶制剂，是世界上报道的首个可以降解虾壳粉的几丁质酶，该研究也是首次以酶制剂形式将几丁质酶添加到饲料原料中，为几丁质酶的应用提供了新的思路和方法。此外，为了提高几丁质的降解效率，本实验从该菌中克隆了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（几丁二糖酶）基因nagB565，在大肠杆菌pET系统中进行了高效表达，纯化后测得重组酶的酶活力为2257U/mL，比活力为7328U/mg，是目前报道比活力最高的几丁二糖酶。对其进行酶学性质分析，结果显示该酶的最适pH为7.0，在pH5.0-9.0间都很稳定，保持70%以上的相对酶活；最适温度为37°C，在30-70°C之间，随着处理温度的升高，酶活逐渐降低，30°C以下的处理对酶活性没有影响；同时该酶对多种金属离子及中性蛋白酶具有良好的抗性；NagB565表现出对几丁寡糖具有不同程度的降解作用，但以几丁二糖最高，具体产物还需利用HPLC系统进行分析。基于以上性质，NagB565符合水产养殖环境条件，也是一种潜在的水产饲用添加剂，可以帮助几丁质酶更彻底地完成降解过程。下一步我们将对其进行水产养殖的有效性和安全性评价。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 几丁质
• 1.1.1 几丁质的结构及应用
• 1.1.2 几丁质降解产物的研究与应用
• 1.2 微生物几丁质降解酶的研究进展
• 1.2.1 产几丁质酶的微生物
• 1.2.2 微生物几丁质酶的分子生物学特点
• 1.3 微生物几丁质酶的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 几丁质酶基因的克隆、表达及酶学性质分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 工具酶与试剂
• 2.1.3 相关溶液
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 引物合成
• 2.1.7 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 维氏气单胞菌B565 基因组的提取
• 2.2.2 几丁质酶chiB565 基因的克隆
• 2.2.3 目的基因的纯化
• 2.2.4 真核表达载体pPIC9-chiB565 的构建
• 2.2.5 pPIC9-chiB565 连接产物的转化及验证
• 2.2.6 pPIC9-chiB565 在毕赤酵母中的表达及检测
• 2.2.7 重组几丁质酶ChiB565 的纯化及鉴定
• 2.2.8 重组几丁质酶ChiB565 的酶学性质分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细菌基因组的提取
• 2.3.2 几丁质酶基因的克隆
• 2.3.3 真核表达载体pPIC9-chiB565 的构建
• 2.3.4 pPIC9-chiB565 连接产物的转化及验证
• 2.3.5 重组几丁质酶ChiB565 的纯化及鉴定
• 2.3.6 重组几丁质酶ChiB565 的酶学性质分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 重组几丁质酶在水产养殖中的应用
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与实验用鱼
• 3.1.2 引物、试剂与工具酶
• 3.1.3 基础饲料与实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 虾壳粉体外降解实验
• 3.2.2 HPLC分析降解产物
• 3.2.3 罗非鱼饲喂实验
• 3.2.4 生长指标的测定
• 3.2.5 细胞因子表达水平的检测
• 3.2.6 攻毒试验
• 3.2.7 数据处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 虾壳粉体外降解试验结果
• 3.3.2 产物分析
• 3.3.3 ChiB565 对罗非鱼生长性能的影响
• 3.3.4 ChiB565 对罗非鱼应激性和非特异性免疫的影响
• 3.3.5 ChiB565 对罗非鱼抗嗜水气单胞菌感染的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及性质分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 引物合成
• 4.1.3 试剂与工具酶
• 4.1.4 溶液
• 4.1.5 培养基
• 4.1.6 主要实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 维氏气单胞菌B565 基因组的提取
• 4.2.2 nagB565 基因的扩增
• 4.2.3 目的基因的纯化
• 4.2.4 原核表达载体pET-28a（+）-nagB565 的构建
• 4.2.5 pET-28a（+）-nagB565 连接产物的转化及筛选
• 4.2.6 pET-28a（+）-nagB565 在大肠杆菌中的表达及检测
• 4.2.7 重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的测定
• 4.2.8 重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的纯化
• 4.2.9 重组β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学性质分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆
• 4.3.2 原核表达载体pET28a（+）-nagB565 的构建
• 4.3.3 NagB565 在大肠杆菌中的表达
• 4.3.4 重组NagB565 活性的测定
• 4.3.5 重组NagB565 的纯化
• 4.3.6 重组NagB565 的酶学性质分析
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历