电离辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞自噬及其与凋亡关系的研究

论文摘要

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。近年来,我国妇女乳腺癌的发病率呈明显上升趋势。乳腺癌的治疗主要包括手术、放疗和化疗,但这些疗法都存在一定的局限性,不能达到彻底根治的目的。特别是,在放疗诱导乳腺癌细胞凋亡过程中,常会出现肿瘤细胞的辐射耐受现象,从而逃逸凋亡,达不到理想的治疗效果。然而,自噬性死亡是区别于细胞凋亡的另一种细胞程序性死亡路径,可能逃逸凋亡的肿瘤细胞发生自噬性死亡。因此,电离辐射诱导乳腺癌细胞自噬性死亡正在成为乳腺癌治疗的一个新热点。本研究应用生物化学、细胞生物学和分子生物学方法,以及电离辐射联合自噬和凋亡抑制剂、诱导剂,建立基因过表达和干扰模型,观察电离辐射诱导人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡、自噬、细胞周期进程、基因和蛋白水平表达的变化。探讨电离辐射诱导肿瘤细胞自噬及其与凋亡的相关性,为提高乳腺癌放疗临床应用提供理论和实验依据。实验结果表明,电离辐射能够诱导MCF-7细胞自噬和凋亡；电离辐射联合自噬抑制剂和泛凋亡抑制剂有促进MCF-7细胞增殖和抑制凋亡的作用。电离辐射联合自噬诱导剂使beclin-1、LC3B、p53和Bax mRNA表达升高,Akt1和Bcl-2mRNA表达降低；电离辐射联合自噬抑制剂使beclin-1、LC3B、p53和Bax mRNA表达降低；Akt1和Bcl-2 mRNA表达升高；电离辐射联合凋亡抑制剂使LC3B、Bax和p53 mRNA表达降低,Bcl-2和Aktl mRNA相对表达量显著升高,beclin-1 mRNA相对表达无明显改变。在基因过表达和干扰模型中,beclin-1基因过表达能够促进MCF-7细胞自噬性死亡,细胞增殖减缓,G2/M期阻滞,细胞凋亡增加。beclin-1和p53蛋白表达增加。Akt1基因干扰促进了MCF-7细胞凋亡和自噬性死亡。Akt1基因干扰使MAP1LC3B和p53 mRNA相对表达升高,Bcl-2 mRNA相对表达降低。Akt1基因过表达则抑制MCF-7细胞凋亡和自噬性死亡电离辐射在诱导MCF-7细胞自噬的同时,也诱导了凋亡。Beclin-1基因能够正调控MCF-7细胞自噬和凋亡。Akt1基因负调控MCF-7细胞自噬和凋亡自噬与凋亡虽然是两条不同的程序性细胞死亡途径,但二者有重叠部分。

论文目录

• 内容提要
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 电离辐射
• 1.1.1 电离辐射的概念和作用类型
• 1.1.2 电离辐射引起DNA损伤与修复
• 1.1.3 细胞的放射敏感性
• 1.1.4 电离辐射对细胞周期进程的影响
• 1.1.5 电离辐射诱导细胞死亡的形式
• 1.1.6 辐射诱导的细胞突变及恶性转化
• 1.1.7 放射治疗
• 1.2 细胞凋亡及分子调控机制
• 1.2.1 细胞凋亡的概念
• 1.2.2 细胞凋亡的基本特征
• 1.2.3 细胞凋亡的检测方法
• 1.2.4 细胞凋亡的信号传导通路
• 1.2.5 细胞凋亡的基因调控
• 1.2.6 细胞凋亡与肿瘤辐射敏感性
• 1.3 细胞自噬及分子调控机制
• 1.3.1 自噬的概述
• 1.3.2 自噬的分类
• 1.3.3 自噬的主要作用
• 1.3.4 自噬的发生过程
• 1.3.5 自噬体的检测
• 1.3.6 真核细胞中自噬的分子调控
• 1.4 自噬和凋亡在肿瘤中的作用
• 1.4.1 参与调控自噬和凋亡的癌基因和抑癌基因
• 1.4.2 自噬在肿瘤中的作用
• 1.5 自噬与凋亡的关系
• 1.5.1 自噬与凋亡对细胞的影响
• 1.5.2 参与自噬和凋亡的重要分子
• 1.5.3 自噬与凋亡的联系
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试剂与器材
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 器材
• 2.2 细胞生物学实验方法
• 2.2.1 细胞的培养
• 2.2.2 细胞培养试剂的配制
• 2.2.3 细胞的冻存及复苏
• 2.2.4 细胞增殖检测
• 2.2.5 PI单染法检测细胞周期
• 2.2.6 Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡
• 2.2.7 MDC荧光染色检测自噬
• 2.2.8 电离辐射诱导MCF-7细胞凋亡的检测
• 2.3 分子生物学实验方法
• 2.3.1 细菌培养技术
• 2.3.2 beclin-1过表达载体的构建
• 2.3.3 beclin-1过表达细胞模型的建立
• 2.3.4 beclin-1基因干扰细胞模型的建立
• 2.3.5 Akt1基因过表达和干扰细胞模型的建立
• 2.3.6 Real time PCR检测基因mRNA水平表达
• 2.3.7 Western blot检测MCF-7细胞蛋白表达
• 2.4 统计学处理
• 第3章 实验结果
• 3.1 电离辐射诱导MCF-7细胞自噬与凋亡的检测
• 3.1.1 MDC染色检测MCF-7细胞自噬
• 3.1.2 DNA ladder检测MCF-7细胞凋亡
• 3.2 自噬/凋亡诱导剂或抑制剂对MCF-7细胞自噬与凋亡的影响
• 3.2.1 不同剂量X射线照射MCF-7细胞对细胞增殖的影响
• 3.2.2 4Gy照射联合自噬诱导剂及自噬和凋亡抑制剂对MCF-7细胞增殖的作用
• 3.2.3 4Gy照射联合自噬诱导剂及自噬和凋亡抑制剂对MCF-7细胞凋亡的作用
• 3.2.4 电离辐射联合自噬和凋亡诱导剂、抑制剂对MCF-7细胞基因水平表达的影响
• 3.3 BECLIN-1基因在电离辐射诱导MCF-7细胞自噬与凋亡中的作用
• 3.3.1 beclin-1基因过表达与干扰模型的构建及鉴定
• 3.3.2 4Gy照射对MCF-7细胞beclin-1基因过表达和干扰的生物效应的影响
• 3.3.3 4Gy照射后beclin-1和p53蛋白表达的时程变化
• 3.4 AKT1基因在电离辐射诱导MCF-7细胞自噬与凋亡中的作用
• 3.4.1 MCF-7细胞中Akt1基因过表达与干扰细胞模型的建立
• 3.4.2 4Gy照射对MCF-7细胞Akt1基因过表达和干扰的生物效应影响
• 3.4.3 4Gy照射MCF-7、MCF-7-Akt1和MCF-7-Akt1Ri细胞后自噬和凋亡基因水平的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 离辐射诱导肿瘤细胞自噬与凋亡
• 4.1.1 离辐射诱导肿瘤细胞自噬
• 4.1.2 电离辐射诱导肿瘤细胞凋亡
• 4.2 电离辐射联合自噬/凋亡诱导剂或抑制剂对MCF-7细胞自噬与凋亡的影响
• 4.2.1 X射线照射联合自噬诱导剂及自噬和凋亡抑制剂对MCF-7细胞增殖的作用
• 4.2.2 4Gy照射联合自噬诱导剂及自噬和凋亡抑制剂对MCF-7细胞凋亡的作用
• 4.2.3 电离辐射联合自噬和凋亡诱导剂、抑制剂对MCF-7细胞基因水平表达的影响
• 4.3 BECLIN-1基因的作用
• 4.3.1 beclin-1基因过表达与干扰模型的构建及鉴定
• 4.3.2 4Gy照射对MCF-7细胞beclin-1基因过表达和干扰的生物效应的影响
• 4.3.3 4Gy照射人乳腺癌细胞beclin-1和p53蛋白表达的变化
• 4.4 AKT1基因的作用
• 4.4.1 MCF-7细胞中Akt1基因过表达与干扰细胞模型的建立
• 4.4.2 4Gy照射对MCF-7细胞Akt1基因过表达和干扰的生物效应影响
• 4.4.3 4Gy照射MCF-7、MCF-7-Akt1和MCF-7-Akt1Ri细胞后自噬和凋亡基因的表达
• 第5章 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 教育背景
• 发表论著
• 致谢