本文主要研究内容
作者高鑫（2019）在《米曲霉来源β-半乳糖苷酶的分子改造及其制备低聚半乳糖的研究》一文中研究指出：低聚半乳糖（GOS）是一类益生效果良好的低聚糖,被广泛应用于食品和保健品行业。工业上一般采用β-半乳糖苷酶催化乳糖获得。目前,日本拥有比较成熟的工业生产技术,年产量也居于世界首位,而国内由于欠缺性能较好的β-半乳糖苷酶、生产技术落后等原因,目前对GOS的生产还处于落后水平。本研究将米曲霉（Aspergillus oryzae RIB40）来源的β-半乳糖苷酶连接到表达载体pPIC9K上,并将重组质粒转入毕赤酵母（Pichia pastoris KM71）,获得了能够表达β-半乳糖苷酶的重组菌。通过定点突变的方法获得了三株转苷能力提升的突变体,并对突变体及野生型酶生产GOS的反应条件进行了优化,对转苷能力最高的双突变体N140C/W806进行了3 L罐发酵,最后分析了突变体产生效果的原因,并对原因进行了验证。主要研究结果如下:（1）将米曲霉来源的β-半乳糖苷酶基因连接表达载体,转入Pichia pastoris KM71,获得能够高效表达β-半乳糖苷酶的重组菌,摇瓶酶活达到198.7 U·mL-1,对野生型基因进行定点突变,获得了多株转苷能力提升的突变株。对突变体动力学参数进行分析,其中,N140C及N140C/W806F突变体对乳糖的Km值比野生型酶有所提高,说明两个突变体对乳糖亲和力下降,水解活性降低,符合实验预期。（2）对突变体及野生型酶生产GOS的条件进行了优化。两个单突变体生产GOS的能力均比野生型有所提高,其中W806F突变体在最优条件下生产GOS的产率达到49.3%,N140C单突变体最优条件下生产GOS的产率达到50.7%,比野生型酶分别提高了35.2%及31.5%。双突变体N140C/W806F的最佳反应条件:乳糖浓度600 g·L-1、加酶量2.5U·mL-1、反应温度为40℃,反应pH 4.5,反应时间7 h。其最终产率为59.8%,比野生型提高了59.2%。对双突变体N140C/W806F进行了3 L罐发酵优化,确定最佳诱导温度为28℃,此时双突变体酶活达到65.3 U·mL-1,比摇瓶提高4.44倍。（3）对突变体产生效果的原因进行了分析,认为N140C突变点氨基酸残基的改变导致半乳糖基氢键的破坏,从而影响水解反应和转苷反应,使得转苷反应相对占据优势,进而最终提高产率。W806F突变产生的效果与此位置疏水性增加有关,疏水性增强降低了水作为受体参与反应的机会,相应的糖基作为受体的反应得到增强,从而提高转苷能力。设计正向突变N140A以及反向突变W806H,其中N140A突变后,生产GOS的产率达到44.9%,比野生型高19.7%,W806H生产GOS产率为22.7%,比野生型降低,成功验证了我们对突变产生效果原因的推测。
Abstract
di ju ban ru tang （GOS）shi yi lei yi sheng xiao guo liang hao de di ju tang ,bei an fan ying yong yu shi pin he bao jian pin hang ye 。gong ye shang yi ban cai yong β-ban ru tang gan mei cui hua ru tang huo de 。mu qian ,ri ben yong you bi jiao cheng shou de gong ye sheng chan ji shu ,nian chan liang ye ju yu shi jie shou wei ,er guo nei you yu qian que xing neng jiao hao de β-ban ru tang gan mei 、sheng chan ji shu la hou deng yuan yin ,mu qian dui GOSde sheng chan hai chu yu la hou shui ping 。ben yan jiu jiang mi qu mei （Aspergillus oryzae RIB40）lai yuan de β-ban ru tang gan mei lian jie dao biao da zai ti pPIC9Kshang ,bing jiang chong zu zhi li zhuai ru bi chi jiao mu （Pichia pastoris KM71）,huo de le neng gou biao da β-ban ru tang gan mei de chong zu jun 。tong guo ding dian tu bian de fang fa huo de le san zhu zhuai gan neng li di sheng de tu bian ti ,bing dui tu bian ti ji ye sheng xing mei sheng chan GOSde fan ying tiao jian jin hang le you hua ,dui zhuai gan neng li zui gao de shuang tu bian ti N140C/W806jin hang le 3 Lguan fa jiao ,zui hou fen xi le tu bian ti chan sheng xiao guo de yuan yin ,bing dui yuan yin jin hang le yan zheng 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）jiang mi qu mei lai yuan de β-ban ru tang gan mei ji yin lian jie biao da zai ti ,zhuai ru Pichia pastoris KM71,huo de neng gou gao xiao biao da β-ban ru tang gan mei de chong zu jun ,yao ping mei huo da dao 198.7 U·mL-1,dui ye sheng xing ji yin jin hang ding dian tu bian ,huo de le duo zhu zhuai gan neng li di sheng de tu bian zhu 。dui tu bian ti dong li xue can shu jin hang fen xi ,ji zhong ,N140Cji N140C/W806Ftu bian ti dui ru tang de Kmzhi bi ye sheng xing mei you suo di gao ,shui ming liang ge tu bian ti dui ru tang qin he li xia jiang ,shui jie huo xing jiang di ,fu ge shi yan yu ji 。（2）dui tu bian ti ji ye sheng xing mei sheng chan GOSde tiao jian jin hang le you hua 。liang ge chan tu bian ti sheng chan GOSde neng li jun bi ye sheng xing you suo di gao ,ji zhong W806Ftu bian ti zai zui you tiao jian xia sheng chan GOSde chan lv da dao 49.3%,N140Cchan tu bian ti zui you tiao jian xia sheng chan GOSde chan lv da dao 50.7%,bi ye sheng xing mei fen bie di gao le 35.2%ji 31.5%。shuang tu bian ti N140C/W806Fde zui jia fan ying tiao jian :ru tang nong du 600 g·L-1、jia mei liang 2.5U·mL-1、fan ying wen du wei 40℃,fan ying pH 4.5,fan ying shi jian 7 h。ji zui zhong chan lv wei 59.8%,bi ye sheng xing di gao le 59.2%。dui shuang tu bian ti N140C/W806Fjin hang le 3 Lguan fa jiao you hua ,que ding zui jia you dao wen du wei 28℃,ci shi shuang tu bian ti mei huo da dao 65.3 U·mL-1,bi yao ping di gao 4.44bei 。（3）dui tu bian ti chan sheng xiao guo de yuan yin jin hang le fen xi ,ren wei N140Ctu bian dian an ji suan can ji de gai bian dao zhi ban ru tang ji qing jian de po huai ,cong er ying xiang shui jie fan ying he zhuai gan fan ying ,shi de zhuai gan fan ying xiang dui zhan ju you shi ,jin er zui zhong di gao chan lv 。W806Ftu bian chan sheng de xiao guo yu ci wei zhi shu shui xing zeng jia you guan ,shu shui xing zeng jiang jiang di le shui zuo wei shou ti can yu fan ying de ji hui ,xiang ying de tang ji zuo wei shou ti de fan ying de dao zeng jiang ,cong er di gao zhuai gan neng li 。she ji zheng xiang tu bian N140Ayi ji fan xiang tu bian W806H,ji zhong N140Atu bian hou ,sheng chan GOSde chan lv da dao 44.9%,bi ye sheng xing gao 19.7%,W806Hsheng chan GOSchan lv wei 22.7%,bi ye sheng xing jiang di ,cheng gong yan zheng le wo men dui tu bian chan sheng xiao guo yuan yin de tui ce 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的高鑫，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于半乳糖苷酶论文,定点突变论文,转苷反应论文,低聚半乳糖论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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