上皮间质转化对人卵巢癌侧群细胞比例的调节作用

论文摘要

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,其发病隐匿,发现时多处于晚期,预后差。临床上强烈化疗药及抗血管生成药物治疗仍有部分患者复发,因此积极探讨卵巢癌转移机制,寻找新的早期转移预测指标及干预措施具有潜在的临床应用价值。近来研究发现,上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）这一现象与肿瘤转移密切相关。EMT是指在特定的生理和病理情况下,具有极性的上皮细胞向在细胞基质间自由移动的间质细胞转化的现象。上皮细胞表型的丧失和间质特性的获得是EMT发生的主要特征。这种表型的转化使肿瘤细胞摆脱细胞间黏附,从而表现得更具侵袭能力。由于肿瘤细胞与干细胞之间在生长特性、抗原表型等方面存在着许多相似性,因此近年又提出了肿瘤干细胞学说。该学说认为,肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞,在肿瘤中充当干细胞角色,具有无限的自我更新能力,能够产生与上一代完全相同的子代细胞,并有多种分化潜能,能够产生不同表型的肿瘤细胞,使肿瘤在体内不断扩大,或形成新的肿瘤。已经有越来越多的证据表明,至少一些肿瘤中存在肿瘤干细胞,肿瘤干细胞是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的根源。EMT学说和肿瘤干细胞学说各自都无法完整地阐释恶性肿瘤的转移机制。如果把二者结合起来,或许可以有一些新发现。本课题组前期研究工作发现,卵巢癌中确实存在一群少量的干样细胞-侧群细胞（side population, SP）。和主群细胞（non side population, non-SP）相比,SP细胞的增殖、成瘤能力更强,而侵袭能力相对弱。基因芯片结果提示SP细胞高表达上皮样细胞基因,低表达间质样细胞基因。本课题在前期研究的基础上,拟阐明EMT现象在SP细胞的呈现以及EMT进程对SP细胞比例的调控作用。第一部分TGF-β1诱导EMT对人卵巢癌SP细胞比例的调节作用目的分析TGF-β1刺激过程中卵巢癌SP细胞比例的改变。方法选择人卵巢癌细胞株HO8910PM,通过流式细胞分选仪分选出SP和non-SP,进一步体外培养。通过添加生长因子TGF-β1,设置时间梯度,刺激细胞发生EMT,连续观察细胞形态的改变,采用RT-PCR,半定量real-time PCR,流式细胞分选,分别检测细胞中snail、snail2、N-cadherin等与EMT相关基因,Oct-4、Nanog等干细胞多能性相关基因,BCRP1耐药基因水平的改变,最后检测TGF-β1作用后的HO8910PM细胞株中的SP细胞比例。结果分选出的SP和non-SP细胞经体外培养,二者形态差异明显。大多数SP细胞呈现圆形,无突起。non-SP则为梭形,有很长的突起。添加TGF-β1后,体外连续培养观察,发现SP细胞渐渐伸展,有突起形成,而non-SP的突起变得更长,显示EMT形态学的特征性改变。收集不同时间段的TGF-β1作用的SP和non-SP, PCR分析提示随着刺激时间的增加,EMT相关的基因snail、snail2、N-cadherin的表达在SP和non-SP皆增加,并且和non-SP细胞相比,SP细胞对TGF-β1的反应更加明显。再者,SP细胞多能性基因OCT-4、Nanog的表达皆强于non-SP,在TGF-β1作用72h后上述基因表达显著下调,表明SP的的干细胞样多能性降低。流式细胞仪检测TGF-β1作用72h后HO-8910PM的SP细胞比例显著下降。结论TGF-β1刺激能诱导SP从上皮样细胞向间质样细胞转变,并上调间质细胞相关基因的表达,并且降低SP的干样多能性,导致SP细胞比例下降。第二部分Snaill-SiRNA阻断EMT对卵巢癌SP细胞比例的调节作用目的分析阻断EMT进程后SP细胞比例的变化。方法利用基因芯片筛选在SP和non-SP表达差异显著的基因Snail1,构建Snaill-SiRNA载体,转染HO8910PM细胞,流式细胞仪鉴定转染效率。采用RT-PCR, Westernblot鉴定SiRNA载体对Snail1表达的下调效应,以及EMT相关表型的变化。针对稳定转染的细胞株,采用流式细胞仪检测干扰后的细胞中SP细胞比例的变化。结果构建的Snaill-SiRNA载体有效地下调Snail1的表达,并且阻断EMT。经过流式细胞仪检测,转染后的细胞株中SP细胞比例下降。进一步采用Hoechst33342/PI染色,发现SiRNA下调Snail1的表达促使细胞凋亡增加。结论Snaill-SiRNA载体阻断EMT后SP细胞比例下降,可能是通过促使细胞的凋亡而下调SP细胞比例。综上所述,本研究发现：EMT过程中SP细胞比例发生变化：（1）：TGF—β1诱导EMT进展的过程中,促进SP细胞从上皮样细胞向间质细胞转化,并降低SP细胞干细胞样多能性,导致SP细胞比例下降；（2）：SiRNA下调转录因子snaill的表达能够阻断EMT的进展,可能通过促进细胞的凋亡而下调SP细胞的比例；（3）：TGF-β1刺激和Snaill-SiRNA都可以下调SP细胞比例,但二者对肿瘤的发生发展及其调控机制仍需要进一步研究。本研究为研究卵巢癌转移及复发机制提供了新的研究思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 TGF-β诱导EMT对人卵巢癌SP细胞比例的调节作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Snaill-SiRNA载体阻断EMT对卵巢癌SP #16比例的调节作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 英文缩略语
• 附录2 硕士期间发表的论文
• 综述
• 参考文献