共轭亚油酸和二十二碳六烯酸对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

论文摘要

大量研究显示,多不饱和脂肪酸在体内和体外可以抑制多种肿瘤细胞生长和诱导凋亡。近年来,子宫内膜癌已成为最常见的妇科恶性肿瘤之一,并且其发病率逐年增加。但是有关不饱和脂肪酸对子宫内膜癌的抑制作用尚未见报道。本论文主要研究亚油酸（LA）,顺9,反11-共轭亚油酸（c9,t11-CLA）,反10,顺12-共轭亚油酸（t10, c12-CLA）和二十二碳六烯酸（DHA）对子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡的影响及其作用机制。应用MTT法检测LA, c9, t11-CLA, t10, c12-CLA和DHA对RL95-2细胞活力的影响。结果显示,LA和t10, c12-CLA对细胞生长没有明显的抑制作用,c9, t11-CLA和DHA对RL95-2细胞生长具有明显的抑制作用,且其作用呈现剂量依赖性和时间依赖性。通过荧光显微镜观察形态学变化,同时通过流式细胞仪定量检测RL95-2细胞的凋亡率。结果显示,40～160μmol/L c9, t11-CLA和DHA分别处理RL95-2细胞48h后,凋亡率均达到70%以上。在上述结果基础上,进一步探讨了两种脂肪酸诱导RL95-2细胞凋亡的机制。采用蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,磷酸化雌激素受体α/雌激素受体α（p-ERα/ERα）,磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B（p-Akt/Akt）以及天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）蛋白的表达水平。结果显示,40μmol/L c9, t11-CLA主要是通过上调Bax/Bcl-2的比例来诱导凋亡,当浓度达到80μmol/L时,c9,t11-CLA除了影响Bax蛋白的表达外,还抑制雌激素受体α的活性,同时检测到活化型caspase-3蛋白的表达增加。40μmol/L DHA诱发凋亡的途径与80μmol/L c9, t11-CLA具有一致性。而80μmol/L DHA不但可以上调Bax蛋白的表达,下调p-ERα/ERα的比例,还可以显著地抑制p-Akt的表达。同时DHA实验组中caspase-3蛋白表达也增加。本论文研究表明,c9, t11-CLA和DHA可以诱导子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡。同时发现,c9, t11-CLA可能通过调节凋亡蛋白Bcl-2家族蛋白的表达和抑制雌激素受体α的活性进而诱发凋亡。DHA诱导RL95-2细胞凋亡与Bax/Bcl-2, p-ERα/ERα以及p-Akt/Akt均有一定相关性。本研究为多不饱和脂肪酸作为功能食品和肿瘤生物治疗方面提供了有效的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.1.1 子宫内膜癌
• 1.1.2 雌激素和雌激素受体
• 1.1.3 蛋白激酶B
• 1.2 多不饱和脂肪酸研究进展
• 1.2.1 多不饱和脂肪酸概述
• 1.2.2 PUFA生理功能
• 1.2.2.1 增进神经系统功能,益智健脑
• 1.2.2.2 抑制肿瘤
• 1.2.2.3 抑制血栓和预防心肌梗塞
• 1.2.2.4 降血脂和预防动脉粥样硬化
• 1.2.2.5 抗炎和抑制过敏反应
• 1.3 CLA的结构、来源及生理功能
• 1.3.1 CLA结构和来源
• 1.3.2 CLA的生理功能
• 1.3.2.1 抗癌作用
• 1.3.2.2 抗动脉粥样硬化及调节血压
• 1.3.2.3 减肥作用
• 1.3.2.4 免疫调节作用
• 1.3.2.5 改善骨组织代谢
• 1.3.2.6 其他作用
• 1.4 细胞凋亡
• 1.4.1 细胞凋亡的形态学特征
• 1.4.2 细胞凋亡的信号途径
• 1.4.2.1 死亡受体途径
• 1.4.2.2 内质网途径
• 1.4.2.3 线粒体途径
• 1.4.3 凋亡基因
• 1.4.3.1 Bcl-2基因家族
• 1.4.3.2 p53基因
• 1.4.3.3 C-myc基因
• 1.4.3.4 Fas基因
• 1.4.3.5 Caspase家族
• 1.4.4 细胞凋亡的检测方法
• 1.4.4.1 形态学观察
• 1.4.4.2 DAPI染色法
• 1.4.4.3 FDA-PI-Hoechst三重染色法
• 1.4.4.4 TUNEL检测法
• 1.4.4.5 流式细胞分析法
• 1.4.4.6 酶联免疫吸附法
• 1.4.4.7 线粒体势能检测
• 1.5 研究意义
• 1.6 研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 试剂配制
• 2.1.4.1 PBS磷酸盐缓冲溶液
• 2.1.4.2 胰蛋白酶
• 2.1.4.3 药物配制
• 2.1.4.4 冻存液
• 2.1.4.5 MTT溶液
• 2.1.4.6 Hoechst 33342溶液
• 2.1.4.7 脱色液
• 2.1.4.8 考马斯亮蓝染液
• 2.1.4.9 Western Blot溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 子宫内膜癌细胞的常规培养
• 2.2.1.1 细胞复苏
• 2.2.1.2 细胞培养
• 2.2.1.3 细胞传代
• 2.2.1.4 细胞冻存
• 2.2.1.5 细胞计数
• 2.2.2 MTT法检测细胞活力
• 2.2.2.1 原理
• 2.2.2.2 方法
• 2.2.3 荧光显微镜观察细胞凋亡
• 2.2.3.1 原理
• 2.2.3.2 操作步骤
• 2.2.4 Annexin V-FITC检测细胞凋亡
• 2.2.4.1 原理
• 2.2.4.2 操作步骤
• 2.2.5 蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白
• 2.2.5.1 原理
• 2.2.5.2 蛋白提取和定量
• 2.2.5.3 SDS-PAGE电泳
• 2.2.5.4 转膜
• 2.2.5.5 封闭
• 2.2.5.6 一抗孵育
• 2.2.5.7 洗去一抗
• 2.2.5.8 孵育二抗
• 2.2.5.9 洗去二抗
• 2.2.5.10 ECL显色
• 2.2.6 统计学分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 不饱和脂肪酸对RL 95-2细胞活力的影响
• 3.2 c9,t11-CLA和DHA对子宫内膜细胞RL 95-2凋亡的影响
• 3.2.1 形态学观察结果
• 3.2.2 Annexin V-FITC/PI定量分析细胞凋亡
• 3.3 c9,t11-CLA和DHA诱导RL 95-2细胞凋亡机制的探讨
• 3.3.1 c9,t11-CLA和DHA对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响
• 3.3.2 c9,t11-CLA和DHA对ERα,p-ERα表达的影响
• 3.3.3 c9,t11-CLA和DHA对AKT,p-AKT表达的影响
• 3.3.4 c9,t11-CLA和DHA对caspase-3蛋白表达的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢