论文摘要
目的:本实验室以前的工作表明,细胞因子白介素-6（interleukin-6,IL-6 ）具有保护神经元、抵抗谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）的兴奋性神经毒作用。已知神经元凋亡与许多脑疾病和脑损伤密切相关,而IL-6对神经元凋亡的影响及其作用机制目前尚不明确。为此,本研究在我们以往工作的基础上,一方面通过制备NMDA诱导的神经元凋亡的细胞模型来探讨IL-6保护神经元、抵抗神经元凋亡的作用,另一方面从IL-6的细胞内信号转导途径入手,探索IL-6抗神经元凋亡的作用机制。可望为IL-6应用于临床来防治某些脑损伤和脑疾病提供实验依据。方法:取出生后8 d大鼠的小脑,进行小脑颗粒神经元的培养。根据不同的研究目的,将IL-6（40、120 ng/ml）、JAK抑制剂AG490（5、10μmol/L）和PI3K抑制剂LY294002（5、10μmol/L）分别加入到小脑颗粒神经元的培养液中预孵育8 d,然后用NMDA（100μmol/L）刺激小脑颗粒神经元30 min,诱导神经元凋亡。用Real-time PCR法及Western blot法检测神经元内凋亡相关基因/蛋白和酶的表达水平,即检测抗凋亡成分Bcl-2、促凋亡成员Bax和凋亡关键酶半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl asparate-specific proteinase-3,caspase-3）的mRNA和蛋白的表达水平。同时,用Western blot法检测IL-6、AG490及LY294002作用于神经元时,神经元表达磷酸化的信号转导和转录活化因子（signaltransducer and activator of transcription 3,STAT3）及蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）的水平。结果:未用IL-6预处理的神经元,在用NMDA刺激后,其表达Bcl-2 mRNA和蛋白显著减少,表达Bax mRNA和蛋白明显增加,表达caspase-3 mRNA和蛋白活化片段显著增加。IL-6本身呈现浓度依赖性地增强Bcl-2 mRNA和蛋白的表达,及抑制Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达。神经元用IL-6预孵育后,再用NMDA刺激,神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平与未用IL-6预处理的神经元比较,出现mRNA和蛋白表达一致的Bcl-2上调、Bax和caspase-3下调的变化,这些变化均有显著意义,并且IL-6的作用具有浓度依赖性,即IL-6在较高浓度（120 ng/ml）时,能使NMDA诱导的Bcl-2、Bax和caspase-3的表达变化恢复到未用任何处理的对照水平。神经元用JAK抑制剂AG490和IL-6共同预孵育,再用NMDA刺激后,神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平与仅用IL-6预处理和NMDA刺激的神经元比较,出现mRNA和蛋白表达一致的Bcl-2下调、Bax和caspase-3上调的变化,AG490的这一作用也具有浓度依赖性,即较高浓度的AG490（10μmol/L）阻断IL-6的作用较强,但仍没有使Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平完全回复到未用IL-6预处理的神经元的表达水平,说明AG490可部分阻断IL-6对凋亡基因/蛋白和酶表达的影响。同时,IL-6可上调磷酸化STAT3的表达,AG490明显阻断IL-6对磷酸化STAT3表达上调的作用。神经元用PI3K抑制剂LY294002和IL-6共同预孵育,再用NMDA刺激后,神经元内Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平与仅用IL-6预处理和NMDA刺激的神经元比较,出现mRNA和蛋白表达一致的Bcl-2下调、Bax和caspase-3上调的变化,LY294002的这一作用也具有浓度依赖性,即较高浓度的LY294002（10μmol/L）阻断IL-6的作用较强,但仍没有使Bax和caspase-3的mRNA和蛋白的表达水平完全回复到未用IL-6预处理的神经元的表达水平,说明LY294002可部分阻断IL-6对凋亡基因/蛋白和酶表达的影响。同时,IL-6可上调磷酸化Akt的表达,LY294002明显阻断IL-6对磷酸化Akt表达上调的作用。结论:NMDA抑制Bcl-2表达及增强Bax和caspase-3的表达,表明NMDA可诱导神经元的凋亡。IL-6显著抵抗NMDA诱导的Bcl-2表达下调及Bax和caspase-3表达上调,说明IL-6具有保护神经元、抵抗神经元凋亡的作用。用药物分别抑制IL-6细胞内信号转导分子JAK和PI3K后,其下游蛋白STAT3和Akt的磷酸化被抑制,同时IL-6抗神经元凋亡的作用被阻断,提示IL-6的两条细胞内信号转导途径JAK-STAT3和PI3K-Akt均参与介导IL-6的抗神经元凋亡作用。