交链孢菌激活蛋白激发水稻的应答基因与抗病性分析

论文摘要

激发子作为一类对病原菌无直接毒杀作用却可诱导植物产生多重防御反应的化合物,在植物病虫害生物防治中具有重要应用前景。本研究选用我室从交链孢菌（Alternaria spp.）中分离纯化出具有促进植物生长、提高植物抗病防虫性能的蛋白激发子,就其诱导抗性的作用机理及差异表达基因进行了系列研究: 1) 检测了交链孢菌激活蛋白在诱发水稻幼苗对稻瘟菌抗性中的作用,测定抗性形成过程中两种重要的活性氧H2O2和O2-含量及抗病防御相关酶活性的变化,并测定交链孢菌激活蛋白对水稻抗病信号途径关键基因转录水平的影响。结果表明,水稻幼苗经2μg ml-1激活蛋白喷雾处理后,5d后叶片的稻瘟菌病情指数和平均每叶病斑数开始显著降低,14d时对稻瘟菌的诱抗效果最为明显。在激活蛋白处理后的前5dH2O2含量快速上升,7d后明显下降。O2-含量的变化趋势与H2O2含量的变化相似,表现出先升后降的时序变化趋势。抗病防御相关酶PAL、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性提高,分别于处理后第7、5、9d活性达到高峰。2μg·ml-1交链孢菌激活蛋白处理1d后使水稻幼苗抗病相关基因NPR1和EIN2转录活性增强,3d后使CTR1的转录受到抑制,但不影响PR4的转录。暗示SA和Et两种信号分子协同参与了交链孢菌激活蛋白诱导水稻幼苗对稻瘟菌的抗性过程。 2) 从水稻cDNA文库中随机挑取10000个基因,采用cDNA芯片鉴定交链孢菌激活蛋白引起水稻幼苗基因表达的变化,半定量RT-PCR和Northern杂交对10个表达增强的抗病防御和信号转导相关基因表达进行了验证。2μg ml-1激发子处理5d后,136个基因的表达显著增强,93个基因的表达明显受到抑制。此229个差异表达基因中,15个基因可能参与了信号转导,13个基因参与了抗病防御过程,117个基因是功能不明的新基因,另外的基因则分别参与了转录调控、细胞生长与分裂、细胞内转运、细胞结构、蛋白质合成、加工与储藏、基础代谢、次级代谢和能量利用等过程。其中交链孢菌激活蛋白诱导了细胞色素P450、调节蛋白NPR1、抗坏血酸过氧化物酶、sgt1转录因子、bZIP转录因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸磷酸酶、胞质磷酸二脂酶、硫代硫酸硫转移酶等参与抗病防御和信号转导的基因的表达。半定量RT-PCR对10个表达增强的抗病防御和信号转导相关基因（依次命名为OsAiDG1-10）表达进行的验证表明,除一个基因表达与对照差异不显著和一个基因的表达受抑制外,其余均与cDNA芯片结果相符。Northern blotting分析验证两个差异表达基因OsAiDG3和OsAiDG4的表达模式,结果表现出与cDNA芯片和PCR结果良好的一致性。 3) 采用RT-PCR从水稻叶片cDNA中扩增到ORF为1263bp、1530bp的OsAiDG3和OsAiDG4基因。其中,OsAiDG3编码420aa,分子量为47.2kDa, pI为5.02的蛋白,与许多已知CDPK具有较高同源性。OsdiDG4编码509aa,分子量为57.1kDa,pI为7.74的蛋白,与许多已知RLK具有较高同源性。将OsAiDG3和OsAiDG4构建到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌ER2566宿主菌,经0.5mmol L-1IPTG诱导4h后,SDS-PAGE

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 激发子概述
• 1.1.1 激发子的定义
• 1.1.2 激发子分类
• 1.1.3 激发子诱导的系统性获得抗性
• 1.2 激发子在系统性获得抗性中诱导发生的早期事件
• 1.2.1 GTP结合蛋白的激活
• 2+信号传导'>1.2.2 离子流和Ca²⁺信号传导
• 1.2.3 胞外碱化和胞质酸化
• 1.2.4 活性氧猝发
• 1.2.5 蛋白质磷酸化和去磷酸化
• 1.2.6 1，4，5-三磷酸肌醇和环核苷酸及NO的快速产生
• 1.2.7 防御基因的表达
• 1.2.8 病程相关蛋白和次生代谢物积累
• 1.3 激发子诱导的系统性获得抗性中的信号转导途径
• 1.3.1 SA信号转导
• 1.3.2 JA信号转导
• 1.3.3 乙烯信号转导
• 1.3.4 抗病信号转导途径间的交叉作用
• 1.3.5 多条信号途径经转录因子的整合
• 1.3.6 信号组分通过蛋白质磷酸化和去磷酸化连结
• 1.4 抗病防御和信号转导相关基因在抗病基因工程中应用
• 1.4.1 干扰治病机理的策略
• 1.4.2 利用抗病基因和过敏反应的策略
• 1.4.3 利用信号转导途径的基因工程
• 1.5 研究背景和意义
• 1.6 试验设计
• 第二章 交链孢菌激活蛋白诱发水稻幼苗对稻瘟菌的抗性
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 化学试剂与药品
• 2.1.3 交链孢菌激活蛋白的制备与纯化
• 2.1.4 稻瘟菌孢子悬浮液的制备
• 2.1.5 水稻处理
• 2O₂和O₂^-含量的测定'>2.1.6 H₂O₂和O₂^-含量的测定
• 2.1.7 PAL、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶活性测定
• 2.1.8 基因表达水平的检测
• 2.2 结果与分析
• 2O₂含量的影响'>2.2.1 交链孢菌激活蛋白对H₂O₂含量的影响
• 2^-含量的影响'>2.2.2 交链孢菌激活蛋白对O₂^-含量的影响
• 2.2.3 交链孢菌激活蛋白对PAL酶活性的影响
• 2.2.4 交链孢菌激活蛋白对β-1，3-葡聚糖酶活性的影响
• 2.2.5 交链孢菌激活蛋白对几丁质酶活性的影响
• 2.2.6 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗抗稻瘟病的影响
• 2.2.7 交链孢菌激活蛋白对抗病信号转导途径关键组分转录水平的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗活性氧含量的影响
• 2.3.2 交链孢菌激活蛋白对水稻幼苗抗病防御相关酶活性的影响
• 2.3.3 交链孢菌激活蛋白对水稻抗病信号转导途径相关组分转录水平的影响
• 小结
• 章三章 交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂和药品
• 3.1.3 交链孢菌激活蛋白的制备与纯化
• 3.1.4 蛋白激发子处理水稻叶片
• 3.1.5 总RNA的提取
• 3.1.6 水稻cDNA文库的构建和cDNA芯片分析
• 3.1.7 序列分析
• 3.1.8 半定量RT-PCR分析
• 3.1.9 Northern印迹杂交
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 cDNA芯片鉴定交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因
• 3.2.2 差异表达基因的鉴定与功能分类
• 3.2.3 10个信号转导和防御相关基因的序列分析
• 3.2.4 10个信号转导和防御相关基因的半定量RT-PCR分析
• 3.2.5 差异表达基因OsAiDG3和OsAiDG4基因的Northern杂交分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 cDNA芯片鉴定交链孢菌激活蛋白激发的水稻差异表达基因
• 3.3.2 抗病防御相关基因的差异表达
• 3.3.3 半定量PCR和Northern杂交验证cDNA芯片结果
• 小结
• 第四章 差异表达基因OsAiDG3和OsAiDG4的克隆与原核表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与培养
• 4.1.2 化学试剂与药品
• 4.1.3 总RNA提取和cDNA合成
• 4.1.4 全长基因的获得
• 4.1.5 目的基因的原核表达
• 4.1.6 表达蛋白的SDS-PAGE检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 OsAiDG3和OsAiDG4基因全长cDNA的克隆和序列分析
• 4.2.2 pGEX-6P-1-OsAiDG3和pGEX-6P-1-OsAiDG4表达载体的构建
• 4.2.3 OsAiDG3蛋白的表达
• 4.2.4 OsAiDG4蛋白的表达
• 4.3 讨论
• 4.3.1 OsAiDG3和OsAiDG4的序列分析
• 4.3.2 OsAiDG3和OsAiDG4的表达
• 小结
• 第五章 差异表达基因OsAiDG3和OsAiDG4在抗病性中的作用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 化学试剂与药品
• 5.1.3 培养基成分
• 5.1.4 植物总RNA提取和Northern杂交
• 5.1.5 目的基因的获得
• 5.1.6 植物表达载体pBI121-OsAiDG3和pBI121-OsAiDG4的构建
• 5.1.7 农杆菌介导OsAiDG3和OsAiDG4基因对烟草的转化
• 5.1.8 转基因植株的检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 OsAiDG3和OsAiDG4基因在抗病性不同的水稻品种中的表达
• 5.2.2 pBI121-OsAiDG3和pBI121-OsAiDG4植物表达载体的构建
• 5.2.3 转基因植株的筛选
• 5.2.4 Northern点杂交分析转基因的表达
• 5.2.5 转基因植株中CHI基因的表达
• 5.2.6 转基因植株抗TMV测定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 差异表达基因OsAiDG3和OsAiDG4基因在不同抗性水稻品种中的表达
• 5.3.2 转OsAiDG3和OsAiDG4基因的烟草植株抗病性分析
• 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历