DCs和NSPCs共培养对促进NSPCs增殖和分化及其机制的初步研究

论文摘要

神经干/祖细胞（Neural Stem/Progenitor Cells， NSPCs）是中枢神经中具有分裂潜能和自我更新能力的一类细胞，它可增殖及分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。近年的相关研究发现成年哺乳动物的脑组织仍有新生的神经元不断的产生，突破了以往认为神经细胞在出生前或者在出生后不久就是失去了再生能力相关理论。并且，通过近年的研究表明在成人的中枢系统中，例如侧脑室壁、海马齿状回、室管膜下区、嗅球和脊髓等处存在神经干细胞并且观察到神经细胞再生。同时研究证明了神经干细胞的生理分化具有定向性，可以分化成神经元以维持正常的神经细胞代谢。虽然在成人中枢神经系统内有神经细胞的代谢，但是这种生理性的代偿在脑缺血、急性脊髓损伤以及神经系统退行性变等病理性损伤的修复中的能力不足。所以，NSPCs移植促进功能恢复的研究成为焦点。树突状细胞（dendritic cells, DCs）是已知体内功能是通过提呈抗原活化静息T细胞，抗原提呈是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。同时，DCs自身能分泌多种细胞因子参与机体内环境的调控。Mikami等实验证实：在体外DCs能促进NSPCs的增殖，在局部移植DCs后，活化了内源性NSPCs增殖促进神经轴突的生长，从而促进小鼠SCI后肢功能恢复。本课题组前期研究将DCs与NSPCs局部联合移植对治疗大鼠SCI时发现在局部损伤区域神经营养因子发生了变化,包括NGF（nerve growth factor）、 BDNF（brain-derived neural neurotrophic factor）、NT-3（neurotrophin-3）等的表达量。并且，Huaben等认为DCs是抗原提呈的作用改变了内环境，为脊髓损伤修复创造了条件。所以，内环境的改变是否是与神经营养因子有关，神经营养因子是否与DCs与NSPCs的相互作用有关，尚待进一步的探讨。我们假设DCs和NSPCs在体外共培养后促进NSPCs增殖和分化的现象与共培养中神经营养因子变化有关。我们实验采用体外将两种细胞共培养，在特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a阻断Trk家族受体和添加NT-3蛋白等实验因素作用下观察共培养各组NSPCs增殖情况和表面TrkC受体表达的变化，以及培养上清NT-3表达变化，初步探讨DCs与NSPCs相互作用的机制。研究目的：本研究拟通过体外实验观察DCs与NSPCs的相互作用，并进一步研究NT-3在DCs与NSPCs相互作用中的信号转导机制。1、构建DCs和NSPCs的共培养体系，观察DCs和NSPCs的相互作用，对作用后的NSPCs直径和数量进行测量。2、检测不同时间点和不同分组的上清中NT-3,BDNF,NGF的表达情况，主要是NT-3的表达量。3、检测共培养后NSPCs表面TrkC蛋白的表达情况。材料与方法：1.未成熟DCs的制备参照Hauben[1]法制备未成熟DCs。简述如下，无菌操作，取SD大鼠（4-6周）双下肢股骨和胫骨的骨髓细胞，消化吹打成单细胞悬液，加入IL-4、GM-CSF细胞因子诱导培养，分别在第2、4、6天半量或全量换液，培养第7天后细胞收集备用。2.新生SD大鼠全脑神经干细胞的制备参照Mistry[2]等培养方法并改良制备NSPCs的原代。简述如下，NSPCs来源普通新生SD大鼠（1-3天）全脑分离，消化吹打成单细胞悬液，加入B27、b-FGF、EGF细胞因子诱导分化，第3、6天换液，增殖培养７ｄ后收集细胞备用。3．DCs与NSPCs Transwell共培养培养方法：将培养第7天的NSPCs和DCs按1×105个/ml，2.5ml （下室）和1×106个/ml，1.5ml（上室，上下室接种密度比10:1）按NSPCs组、DCs/NSPCs+K252a组、DCs/NSPCs组和NSPCs+NT-3组接种于6孔培养板的Transwell共培养系统中，膜孔径为0.4μm上下室的培养液能相互通融。第3天换液1次，在倒置显微镜下观察NSPCs形态变化，第7天拍摄神经球图片，用于神经球直径分析，收集神经球备用。4.免疫细胞荧光术将Transwell共培养的NSPCs收集的悬浮细胞球、细胞爬片球分化用4%多聚甲醛固定，根据预实验浓度加入一抗，4℃过夜，加入二抗在37℃孵育约2小时，Hochest染核。中性树胶封片，激光共聚焦显微镜和普通荧光显微镜下检测。5．ELISA检测Transwell共培养上清中NT-3的量分别检测DCs与NSPCsTranswell共培养上清0、12、24、36、48、60、72小时NT-3检测和不同分组中对NT-3检测。方法参照ELISA试剂盒说明书进行（武汉博士德公司）。6.Westrnblot检测NSPCs表达TrkC的情况将Transwell共培养各组的神经球收集于离心管后，冰上裂解45min，取上清液，各组获得的总蛋白加上样缓冲液混合均匀，煮沸加热5min。取蛋白样品进行SDS-PAGE，在电泳结束后将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后加一抗４℃过夜，复温，辣根过氧化物酶耦联的二抗室温孵育约1h，设β-actin为内参照。7．统计分析本实验内容数据采用SPSS18.0软件进行统计处理。样本算术平均数、标准差和概率值分别以（?）±s、p表示，行单因素方差分析。结果：1．在倒置显微镜下观察各组NSPCs成球情况，发现NSPCs球直径和数量在各组之间均存在着差异，DCs/NSPCs组和NSPCs＋NT-3组NSPCs球数量增多，且平均直径与DCs/NSPCs+K252a组和NSPCs组的比较增大明显（p＜0.05）。2．共培养上清中NT-3、BDNF的表达上调，不同时间点（从0小时开始，每12小时收集一次）发现在48小时NT-3的表达量处于峰值。并且做组间比较DCs/NSPCs组的上清检测出的NT-3含量较DCs组和NSPCs组差异明显（p＜0.05）Cs/NSPCs组和DCs+NSPCs组间比较无明显差异（p＞0.05）。3．细胞免疫荧光染色法检测Transwell共培养NSPCs细胞表面TrkC的表达情况，显示：NSPCs组、DCs/NSPCs+K252a组、DCs/NSPCs组、NSPCs+NT-3组在共培养7天后NSPCs表面TrkC均阳性表达（CY3红色荧光），但是表达的量和荧光强度有差异性，DCs/NSPCs组和NSPCs+NT-3组明显高于NSPCs组和DCs/NSPCs+K252a组（p＜0.05）。4．Western Blot检测显示NSPCs细胞表面表达的TrkC的量按照NSPCs组、DCs/NSPCs+K252a组、DCs/NSPCs组、NSPCs+NT-3组强度渐增。TrkC的表达量（条带灰度值）与内参（β-actin）表达量比值之间的差异有显著性（P <0.05）。说明在共培养体系中是随着NT-3量的增加，其受体TrkC在NSPCs的表达也升高。结论：1．本实验证明，体外DCs和NSPCs共同培养，DCs能够促进NSPCs球直径的增加以及数量的增多。2．DCs和NSPCs共同培养的上清中48小时NT-3的表达量是峰值，DCs+NSPCs组、DCs/NSPCs组48小时上清中NT-3的表达量比DCs组、NSPCs组多，差异显著。3．体外DCs和NSPCs共同培养，免疫细胞荧光检测显示，在NSPCs球表面TrkC的表达量DCs+NSPCs组与DCs/NSPCs组明显高于NSPCs组与DCs/NSPCs+K252a组的表达。4．体外DCs和NSPCs共培养，Western Blot检测显示，NSPCs细胞表面TrkC的表达量在各组间比较有统计学差异，DCs+NSPCs组和DCs/NSPCs组的灰度值明显比NSPCs组与DCs/NSPCs+K252a组的高。 DCs+NSPCs组和DCs/NSPCs组的比较不明显。

论文目录

• 英文缩写一览表
• Abstract
• 摘要
• 前言
• 第一部分 树突细胞和神经干细胞/前体细胞共培养促进神经干细胞/前体细胞增殖和分化的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 树突细胞和神经干细胞/前体细胞共培养促进神经干细胞增殖和分化的机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 问题与展望
• 参考文献
• 文献综述 DCs通过NT-3调控NSPCs增殖、分化的相关的研究
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文