论文摘要
目的 建立一种体外诱导、培养人骨髓间充质干细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）成软骨组织的方法;检验Ⅰ型胶原凝胶作为软骨组织工程载体的可行性;探讨以人骨髓间充质干细胞为种子细胞、Ⅰ型胶原凝胶为载体的软骨组织工程的最佳细胞密度和最佳培养时间。 方法 分别采集6例健康成人骨髓6ml,用全骨髓培养法进行分离,在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养扩增,倒置显微镜下,观察BMSCs在体外单层培养条件下的形态、特征和细胞生长的状况。将培养第三代的BMSCs消化并收集,与Ⅰ型胶原凝胶结合。按照不同的结合密度分为4组:A组为1×104/ml,B组为1×105/ml,C组1×106/ml,D组为5×106/ml。A、B、C、D组均用含10%胎牛血清的诱导培养基(含10ng/ml的rh TGF-β1、丙酮酸钠1mM、地塞米松10-7M、牛胰岛素6.25ug/ml、转铁蛋白6.25ug/ml的高糖DMEM培养基)进行诱导。于诱导培养后第2周,分别取各组细胞-Ⅰ型胶原凝胶盘,行免疫组化检测Ⅱ型胶原的分泌,原位杂交定性分析Ⅱ型胶原mRNA表达,甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖。于2、3、4、5周采用酶标染色法定量测量蛋白多糖（GAG）的含量。 结果 经过全骨髓培养法可以得到形态均一的骨髓间充质干细胞,细胞贴壁后呈长梭型,约3-4周后细胞可铺满,传代培养细胞生长旺盛。B（1×105/ml）、C（1×106/ml）、D（5×106/ml）组在诱导培养2周之后,Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,原位杂交可以检测到Ⅱ型胶原mRNA的表达,甲苯胺蓝染色阳性,均可以测出不同含量的GAG。而A组（1×104/ml）上述指标均为阴性。对不同组GAG含量的比较,为D（5×106/ml）>C（1×106/ml）>B（1×105/ml）组;其中各组不同时间的横向比较,4周>3周>2周,有统计学意义上的差别（P<0.05）。而第5周与第4周比较,无
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