雌激素对Na～+，K～+-ATPase β1亚单位、SERCA2a和IV型碳酸酐酶表达的影响

论文摘要

研究背景与目的：心血管疾病是危害人类健康的“第一杀手”。许多危险因子可增加心血管疾病的发病率，首当其冲的危险因子是老龄。心血管疾病的发生发展大多具有明显的性别差异，年轻女性心血管疾病的发病率低于同龄男性，进入绝经期后，女性患冠心病的危险性迅速地增加3～4倍，达到同龄男性的水平。绝经前后妇女的最主要的生理变化之一是体内雌激素水平的降低，为了降低绝经后妇女心血管疾病发病率，雌激素替代曾风靡一时。近期对雌激素替代疗法有较大的争议。2005年Mendelssohn和Karas在Science上撰文支持雌激素具有心脏保护功能的观点并指出需要在细胞和分子水平深入地阐明雌激素对心血管系统的作用。以往关于雌激素对心脏的保护作用的理解主要集中在“间接保护”方面。随着研究的不断深入，目前关于雌激素是否对心脏具有“直接保护”作用的论题逐渐成为研究的热点。我室的前期研究工作发现雌激素可以保护心脏功能。利用cDNA微阵列技术分析发现雌激素能调节多个基因的表达，其中一组基因尤其引人注目，它们是：Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、肌浆网Ca2+-ATPase 2a(sarcoplasmic／endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)以及Ⅳ型碳酸酐酶（carbonic anhydraseⅣ，CAⅣ）。Na+，K+-ATPase、SERCA和CAⅣ都是维持心肌正常内环境和生理功能不可或缺的重要蛋白，cDNA微阵列的结果提示我们：绝经后雌激素水平下降可能会引起心肌细胞上述蛋白表达的改变从而导致心肌细胞内电解质浓度紊乱、pH失衡和心肌细胞膜电生理特性改变，不可避免地引起心肌细胞损伤，可能也是引起绝经后妇女冠心病高发的重要原因。为此，我们以大鼠源心肌细胞系H9c2为试验对象，研究雌激素对上述三种蛋白表达的调节作用，力求在分子水平从雌激素对心肌细胞离子转运和pH调节这一侧面阐明雌激素对心脏的直接保护作用。第一部分雌激素对Na+，K+-ATPase和SERCA活性及Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ表达影响的研究方法：H9c2细胞用含去雌激素血清的DMEM培养后分组进行试验。①雌二醇长效干预试验：分别以0、0.01 nM、1 nM、100 nM和1μM浓度的雌二醇作用24小时，0雌二醇组作为对照。测定Na+，K+-ATPase和SERCA的活性；用RT-PCR法测定Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ的mRNA表达水平；用Western-blots测定Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ的蛋白表达水平。②雌二醇短效干预试验：用0、1 nM、100 nM浓度的雌二醇分别作用H9c2细胞5 min、10 min、20 min、30 min后测定Na+，K+-ATPase和SERCA的活性，0雌二醇组作为对照。结果：①Na+，K+-ATPase活性在1 nM，100 nM和1μM雌二醇组均较对照有显著的提高（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），当雌二醇浓度为100 nM时，Na+，K+-ATPase活性出现最大值，但与1 nM及1μM雌二醇组比较无统计学意义（p＞0.05，p＞0.05）。SERCA活性在0.01nM，1 nM，100 nM和1μM雌二醇组均较对照有显著的提高（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），当雌二醇浓度为100 nM时，SERCA活性出现最大值，1 nM及1μM雌二醇组较100 nM雌二醇组有显著的降低（p＜0.05，p＜0.05）。1 nM与1μM雌二醇组之间无显著性差异（p＞0.05）。②雌二醇对Na+，K+-ATPase和SERCA的活性无快速调节作用。③与对照组比较，1 nM，100 nM和1μM雌二醇均能提高Na+，K+-ATPaseβ1亚单位在mRNA和蛋白水平的表达（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），雌二醇对Na+，K+-ATPase的活性的调节与Na+，K+-ATPaseβ1亚单位的表达调节的趋势一致。SERCA2a的mRNA和蛋白水平的表达在0.01 nM，1 nM，100 nM和1μM雌二醇组均较对照有显著提高（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），当雌二醇浓度为100 nM时，SERCA2a的mRNA表达出现最大值，1 nM及1μM雌二醇组均显著低于100 nM雌二醇组（p＜0.05，p＜0.05），1nM及1μM雌二醇组之间无统计学差异（p＞0.05）。CAⅣmRNA表达在1 nM、100 nM和1μM雌二醇组均较对照有显著的提高（p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05），当雌二醇浓度为100 nM时CAⅣ的mRNA表达最高，但与1 nM和1μM雌二醇组没有显著差异（p＞0.05，p＞0.05）。Western-blots得到了与RT-PCR一致的结果。结论：①1 nM、100 nM和1μM浓度的雌二醇能够提高Na+，K+-ATPase和SERCA的活性，在mRNA和蛋白水平上调Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ的表达。②雌二醇调节Na+，K+-ATPase和SERCA的活性和Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ的表达表现出一定的量效关系。雌二醇浓度过高（大于100 nM）或过低（小于1 nM）都会导致相应蛋白表达和活性的下降。③雌二醇对Na+，K+-ATPase和SERCA的活性不存在快速调节作用，即雌二醇提高Na+，K+-ATPase和SERCA的活性是通过上调相应的蛋白表达而实现的。④综上，我们推测：本研究的结果支持雌激素对心脏具有直接保护作用的观点；雌激素剂量的选择在雌激素替代治疗中是一个非常重要的因素。第二部分雌激素调控Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ表达的机制的初步研究方法：为进一步明确雌激素对上述蛋白的作用机制，我们使用选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬（tamoxifen，TAM）进行了阻断试验。H9c2细胞用含去雌激素血清的DMEM培养后分组进行试验：①以0、10 nM TAM作用H9c2细胞24小时，0 TAM组作为对照，用以研究TAM对上述蛋白的单独作用。②分别使用1 nM雌二醇，1nM雌二醇+1 nM TAM，1 nM雌二醇+10 nM TAM作用H9c2细胞24小时，1 nM雌二醇组作为对照。阻断试验的测定指标及方法同雌二醇干预试验。结果：①单独加入TAM不能影响Na+，K+-ATPase和SERCA的活性及Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a和CAⅣ的表达。②10nM TAM可显著地抑制由1 nM雌二醇引起的SERCA活性的增加和Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a在mRNA和蛋白水平表达的上调（p＜0.05）。1 nM TAM无明显的上述作用（p＞0.05）。两种浓度的TAM对1 nM雌二醇引起的Na+，K+-ATPase的活性增加及CAⅣ的表达上调没有明显的抑制作用（p＞0.05）。结论：雌激素受体参与了雌激素对Na+，K+-ATPaseβ1亚单位、SERCA2a的表达的调节，雌激素对CAⅣ的表达调节可能另有其他途径。

论文目录

中文摘要

英文摘要

缩略语

前言

技术路线

+,K⁺-ATPase和SERCA活性及Na⁺,K⁺-ATPase β1亚单位、SERCA2a和CA Ⅳ的表达影响的研究'>第一部分雌激素对Na⁺,K⁺-ATPase和SERCA活性及Na⁺,K⁺-ATPase β1亚单位、SERCA2a和CA Ⅳ的表达影响的研究

1.前言

2.材料和方法

2.1 材料

2.1.1 细胞

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养

+,K⁺-ATPase活性的测定'>2.2.2 Na⁺,K⁺-ATPase活性的测定

2.2.3 SERCA活性的测定

2.2.4 蛋白测定

2.2.5 无机磷的测定

2.2.6 RT-PCR

2.2.7 Western-blots

2.2.8 统计学分析

3.结果

3.1 酶活性结果

3.2 RT-PCR结果

3.3 Western-blots结果

4.讨论

+,K⁺-ATPase β1亚单位、SERCA2a和CA Ⅳ表达的机制的初步研究'>第二部分雌激素调控Na⁺,K⁺-ATPase β1亚单位、SERCA2a和CA Ⅳ表达的机制的初步研究