论文摘要
新生儿Fc受体（FcRn）是识别免疫球蛋白IgG Fc片段的特异性受体。大多数疾病的感染均发生在黏膜或由黏膜入侵机体。FcRn可特异性的结合IgG Fc片段,介导黏膜上皮细胞主动转运IgG,使机体获得抵御病原体的能力。因此可以将一个抗原和IgG的Fc片段融合,模拟IgG跨越黏膜表面的转移,就可以通过FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原穿过黏膜屏障。禽流感病毒（Avian Infulenza Virus, AIV）主要通过呼吸道感染机体,本研究用禽流感病毒H5N1的主要保护性抗原血凝素HA1作为模式抗原,通过一个连接（Linker）片段（氨基酸序列：GSGGGGSGGGGSGS）与小鼠IgG2a Fc片段融合（HA1-Linker-wFc,简写为HA1-wFc）,利用Bac-to-Bac表达系统表达HA1和IgG2aFc野生型片段的融合蛋白（HA1-wFc）及HA1和IgG2a Fc突变型片段的融合蛋白（HA1-mFc）。为今后进一步开展以FcRn介导的IgG胞转通路转运抗原的黏膜屏障的研究奠定良好的基础。本研究取得的主要结果如下：1. HA1-wFc基因的克隆根据GenBank上公布的禽流感病毒H5N1 HA1基因（AY830774.1）和小鼠IgG2a Fc基因（V00798.1）序列设计引物,利用实验室保存的质粒pMD18-T-HA1和pMD18-T-wFc为模板,分别扩增了禽流感病毒H5N1 HA1基因和小鼠IgG2a wFc片段基因,其中wFc片段C1q结合位点发生突变而丧失与其结合能力。用Linker把HA1与wFc片段相连（HA1-wFc）,再与pMD18-T载体相连,对得到的阳性重组质粒pMD18-T-HA1-wFc进行序列测定,HA1基因和wFc基因（突变位点除外）与GenBank公布的相应基因序列同源性均为100%。2. HA1-mFc基因的克隆以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc为模板,采用PCR定点突变方法对wFc与FcRn结合的关键位点进行突变,使其丧失与FcRn的结合能力。将HA1-mFc片段连接到pMD18-T载体,对得到的阳性重组质粒pMD18-T-HA1-mFc进行序列测定,HA1基因和mFc基因（突变位点除外）与GenBank公布的相应基因序列同源性均为100%。3.32a-HA1-wFc和KG-HA1融合蛋白的原核表达以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc为模板,将HA1-wFc片段连接到载体pET-32a上构建重组原核表达质粒（pET-32a-HA1-wFc）,并与实验室保存的pGEX-KG-HA1,分别在大肠杆菌中获得了表达,Western blot分析及红细胞凝集试验表明表达的32a-HA1-wFc和KG-HA1融合蛋白均具有良好的免疫学活性。4. HA1-wFc和HAl-mFc融合蛋白在杆状病毒系统中的表达分别以重组质粒pMD18-T-HA1-wFc和pMD18-T-HA1-mFc为模板,利用酶切连接方法分别将HA1-wFc和HA1-mFc基因片段连接到载体pFASTBAC HTb上构建重组真核表达质粒（pFASTBAC HTb-HA1-wFc和pFASTBAC HTb-HA1-mFc）,并利用Bac-to-Bac系统成功获得了表达,Western blot分析及红细胞凝集试验表明表达的HA1-wFc和HA1-mFc融合蛋白均具有良好的免疫学活性。