论文摘要
多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病,有遗传易感性。现普遍认为MS是一种遗传易感个体在某些环境因素影响下通过变态反应性免疫障碍而引发的多病因疾病。近年研究提示,MS两种亚型——西方型和亚洲型不仅临床特征不同,其免疫遗传背景也存在着显著差异。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）包括TNFα和TNFβ,是一种参与免疫应答的细胞因子,分别主要来源于激活的单核巨噬细胞和淋巴细胞,两者具有相似的生物学活性,具有广泛的诱导炎症和调节免疫的功能,而编码TNF的基因具有多态性。TNF基因位于人类6号染色体短臂上,HLA-Ⅲ类基因区内,分别编码TNFα和TNFβ,并与某些HLA单倍体基因紧密连锁。有研究表明TNF水平在MS急性期增高并随病情好转下降;动物实验和病理研究均证实TNF与髓鞘脱失、轴索变性有关。由于TNF的重要免疫学作用及其基因的特殊位置,有必要从分子水平探讨其在MS发病中的作用,我们对TNFα和TNFβ的基因多态性状况及其与MS两种亚型不同病期发病的关系作了以下探讨。目的:1.研究MS两种亚型——西方型和亚洲型的易感性与TNFα和TNFβ基因多态性的关联,从免疫遗传学角度探讨自身内在因素在MS发病中的作用。2.研究两型MS患者不同病期TNFα和TNFβ水平的变化,探讨TNFα和TNFβ在MS发病中的作用。3.探讨MS患者TNFα和TNFβ基因多态性与EDSS评分、病程及发病次数等临床资料之间的关系,进一步探讨基因多态性在MS发病中的作用。4.分析EDSS评分与TNF水平、病程、发病次数及首次发病年龄之间的相关性。5.分析两型MS患者之间在EDSS评分、首次发病年龄、性别、病程及发病次数方面有无差别。方法:1.病例组:选择58例MS患者,均符合1983年Poser等的诊断标准。依据1996年Kira等的方法将MS分为西方型和亚洲型两个亚型,其中西方型MS组22例,亚洲型MS组36例;再根据病程和病情分为急性期MS组37例和缓解期MS组21例。对照组:选择79例无血缘关系的健康人,年龄、性别均与病例组匹配,近期无感染、未应用免疫抑制剂。2.抽取研究对象清晨空腹肘静脉血,并用EDTA抗凝,在三天之内以改良快速盐析法自血中抽提基因组DNA。3.采用聚合酶链（PCR）方法进行TNFα和TNFβ目的基因片段扩增,扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳,结果参照Marker标准判断。4.采用限制性片段长度多态性（RFLP）方法进行TNFα和TNFβ基因多态性分析,在含有0.5%溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳,并应用凝胶图像分析仪观察带型,进行等位基因分型。5.从血液标本中分离血清,-70°C冻存,避免反复冻溶。应用双抗体夹心酶联免疫（ELISA）方法测定血清中TNFα和TNFβ水平。6.对MS组患者分别进行神经功能缺损程度的EDSS （an expanded disability status scale,EDSS）评分、首次发病年龄、病程、发病次数等临床资料收集。7.应用SAS 6.12统计软件对数据进行统计分析。对照组和病例组基因型的分布经Hardy-Weinberg平衡检验,有群体代表性。TNF基因型、等位基因数、性别用直接计数法计数,并计算各等位基因频率,组间比较采用χ2检验。用Woolf公式计算相对风险度（relative risk, RR）大小。TNF水平、EDSS评分、年龄、病程及发病次数以均数±标准差（ x±s）表示,两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析,必要时行多个样本均数两两比较的SNK-q检验。采用相关和逐步多元回归检验EDSS评分与TNFβ水平、年龄、病程及发病次数间的相关性。显著检验水准均为P<0.05。结果: 1. MS组、西方型MS组、亚洲型MS组TNFα基因型分布及等位基因频率分别与正常对照组比较均无明显差异（P>0.05）。2. MS组TNFβ基因型分布与对照组相比有明显差异（P<0.05）;MS组TNFβ1等位基因频率（45.69%）显著高于健康对照组（27.85%）,（P<0.05,RR=2.18）。亚洲型MS组TNFβ基因型分布与对照组相比有明显差异（P<0.05）;亚洲型MS组TNFβ1等位基因频率（51.39%）显著高于健康对照组（27.85%）,（P<0.05,RR=2.74）。而西方型MS组TNFβ基因型分布和等位基因频率与对照组相比均无明显差异（P>0.05）。3. MS组TNFα各基因型组的EDSS评分、首次发病年龄、病程、发病次数组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。4. MS组、西方型MS组、亚洲型MS组TNFβ各基因型组的EDSS评分、首次发病年龄、病程、发病次数分别进行组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。5.⑴急性期MS组TNFα水平为（26.89±14.65 ）pg/mL, TNFβ水平为（607.92±289.13）pg/mL,均较健康对照组明显升高（P<0.05）。⑵缓解期MS组TNFα、TNFβ水平与健康对照组比较均无显著差异（P>0.05）。而缓解期西方型MS组TNFα水平为（19.87±17.97 ）pg/mL与正常对照组比较有显著差异（P<0.05）。⑶急性期MS组TNFα、TNFβ水平均较缓解期MS组明显升高（P<0.05）。而西方型急性期MS组TNFα水平与西方型缓解期MS组比较无显著差异（P>0.05）,且亚洲型急性期MS组TNFβ水平与亚洲型缓解期MS组比较亦无显著差异（P>0.05）。6. EDSS评分与病程、发病次数及首次发病年龄均呈正相关（P<0.05）。7.两亚型在EDSS评分、首次发病年龄、性别、病程、发病次数诸方面均无显著差异（P>0.05）。结论: 1. TNFβ1等位基因频率在MS患者中明显增高,说明该等位基因与MS的易感性相关。携带有TNFβ1等位基因的个体可能更易感染亚洲型MS。2. TNFα基因多态性可能与MS遗传易感性不相关。3. TNFα和TNFβ血清水平在MS急性期升高,并且随着病情的缓解而逐渐恢复正常,说明TNF在MS发病过程中起促进作用,而且可能TNFα和TNFβ分别在亚洲型MS和西方型MS发病过程中的作用更突出。4. TNFα和TNFβ基因多态性与EDSS评分、首次发病年龄、病程、发病次数均无显著相关性。5.西方型和亚洲型MS在EDSS评分、首次发病年龄、性别、病程、发病次数诸方面无显著差异。6. EDSS评分与病程、发病次数及首次发病年龄呈正相关。