转化生长因子β1基因转染人骨髓间充质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

论文摘要

一、背景和目的组织工程器官研究包括种子细胞、瓣膜支架材料以及瓣膜组织的形成和再生构成三大部分。组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve,TEHV）的体外构建首先要将种子细胞成功地种植到瓣膜支架上。细胞和支架之间的相互作用,包括细胞在支架上迁移、分化和增殖等生物活动,都是以细胞和支架的黏附为基础。细胞与瓣膜支架材料的相互作用一直是THEV研究的重要领域,其核心是种子细胞在支架材料上的黏附。目前所使用的瓣膜支架材料有人工合成材料和天然材料,人工合成材料包括聚乳酸（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚羟基烷酸酯类（PHAs）、聚己酸内酯（PCL）及其共聚物等人工合成高分子材料。天然材料包括异种瓣膜支架和同种异体瓣膜支架。但这些材料大多属于生物“隋性”材料,不能为种子细胞的附着和生长提供良好的生物界面。随着研究的深入,研究人员发现,在体外培养的种子细胞增殖缓慢、黏附力低下。根据Simon等的研究发现,去细胞猪主动脉瓣的受体为儿童时,瓣膜寿命明显缩短,提示去细胞猪主动脉瓣仍然存在一定的免疫原性。因此,如何促进种子细胞与瓣膜支架黏附,进而分化、增殖并对支架进行改建仍是TEHV体外构建的关键所在。应用基因转染的方法加强或改造种子细胞的功能是当今组织工程研究中的热点之一,本实验尝试采用基因转染的方法增强种子细胞的黏附力助于体外构建TEHV。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种高活性、多功能生物信号分子,存在于大多数哺乳动物,具有极高的同源性,人和大鼠相比较仅1个氨基酸不同。编码人TGF-β1的基因位于19q13。其生物学作用主要有促进间质细胞的增殖和抑制部分细胞的增殖;促进细胞外基质合成,抑制降解;诱导细胞分化;免疫抑制作用,对免疫活性细胞的表型、增殖、分化和细胞因子的产生具有调节作用。既往我科研究发现,预涂Fn.CBD64和转染Fn.CBD64基因的方法可以增强猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）的黏附力,但Fn.CBD64对BMSCs的增殖无促进作用。因此,我们希望利用TGF-β1具有促进间质细胞的增殖和促进细胞外基质合成、抑制降解的功能来改进种子细胞功能。首先在本实验室原有研究的基础上成功构建TGF-β1基因的重组腺病毒Ad.TGF-β1,然后将其转染的BMSCs种植到去细胞猪瓣膜支架上,考察人BMSCs在支架上的黏附、生长情况以及体外构建的TEHV进行冲刷实验,从而评价转染TGF-β1基因的方法增强种子细胞黏附力的效果。二、方法（一）TGF-β1基因重组腺病毒载体（Ad.TGF-β1）的构建提取人类脾组织总RNA,经RT-PCR获取TGF-β1基因,然后将其插入质粒pET28,筛选获得带有TGF-β1基因的重组质粒,并进行测序鉴定。回收和加工TGF-β1DNA片段后,构建重组粘粒载体pAxCAwt.TGF-β1并进行鉴定和扩增。应用阳离子脂质体法制备重组腺病毒,将鉴定正确的重组腺病毒扩增、纯化和滴度测定。用Hela细胞检测是否有野生型腺病毒产生,确定其使用的安全性。（二）人BMSCs的分离、培养及Ad.TGF-β1转染BMSCs后TGF-β1蛋白表达1、BMSCs的分离和培养:穿刺抽取健康志愿者骨髓液,Percoll密度梯度离心法获取BMSCs,DMEM培养液体外培养扩增,采用CD34、CD71、CD44和Desmin免疫组化染色及流式细胞仪（FCM）等方法对细胞表型进行分析鉴定。2、Ad.TGF-β1转染BMSCs后TGF-β1蛋白表达:以不同MOI值的Ad.GFP转染体外培养的BMSCs,通过流式细胞仪测定转染效率,确定最佳转染倍数。以免疫组化染色、RT-PCR等方法检测转染Ad.TGF-β1后TGF-β1蛋白的表达情况并以细胞计数和MTT法观察转染后BMSCs的增殖生长情况。（三）转染TGF-β1基因增强人BMSCs黏附力的研究1、组织工程心脏瓣叶的体外构建:采用0.025%胰酶8小时+核酸酶+1%DCA持续震荡24小时进行猪主动脉瓣的脱细胞处理,通过组织学切片、电镜检查观察去细胞效果。采用去细胞猪主动脉瓣叶作支架,分组同前,每组8个瓣叶,BMSCs作为种子细胞,体外构建TEHV,于构建后第8天通过瓣叶上BMSCs的光镜计数、MTT法、组织切片、电镜检查和流式细胞仪检测等进行瓣叶上BMSCs的黏附、生长状态和表型鉴定并通过测定瓣膜羟脯氨酸含量判断瓣膜胶原含量的变化。2、TEHV的体外冲刷实验:实验分为2大组,分别为静态组和实验组,每大组再分三小组,分别为对照组、转染Ad.GFP组、转染Ad.TGF-β1组。每组8个瓣叶。均以脱细胞猪主动脉瓣为支架,构建后进行MTT检测及瓣叶细胞计数。实验组构建第7天进行冲刷实验,持续作用24小时。通过瓣叶上BMSCs的光镜计数、MTT法、组织切片等检查观察瓣叶上BMSCs的存留情况。三、结果1、构建了重组腺病毒Ad.TGF-β1,其转染效率高、毒性低、体外使用安全。2、原代培养的BMSCs贴壁后细胞开始增殖并转化为三角形、多角形和梭形。3到4天后,部分区域形成细胞集落。传代细胞呈梭形,呈指数增殖,5ml骨髓液分离得到的BMSCs在体外培养扩增2至3周可获取107～108个细胞。经免疫组织化学检测:CD71、CD44免疫组化阳性,CD34、Desmin组化阴性,符合MSCs的形态和表面标记;流式细胞仪分析,CD71、CD44阳性细胞分别占86.34%和76.61%,说明采用Percoll密度梯度和贴壁相结合的方法,可分离获得较高纯度的BMSCs。腺病毒对细胞有很高的转染效率,MOI值为50时,转染率达95%以上。Ad.TGF-β1转染细胞后72h的免疫组化检测显示细胞内有目的蛋白表达;RT-PCR检测到TGF-β1mRNA表达。Ad.TGF-β1组MTT的OD570吸光值在转染后3天、5天和7天均高于Ad.GFP组和对照组,Ad.GFP组和对照组相比无显著性差异。3、采用0.025%胰蛋白酶+核酸酶+1%DCA相结合的方法能够完全去除猪主动脉瓣叶上的细胞成份,而波浪状纤维支架结构保存完好。（1）用BMSCs自然分化细胞构建的TEHV瓣叶HE染色示转染Ad.TGF-β1组的BMSCs在去细胞瓣叶上紧贴瓣叶表面呈复层生长,形成连续细胞层。对照组和转染Ad.GFP组,虽然在瓣膜表面形成了细胞层,但细胞与基质黏附不紧,瓣膜表面有的部位没有细胞覆盖。扫描电镜示转染Ad.TGF-β1组,BMSCs在瓣膜表面形成较紧密的细胞层。对照组和转染Ad.GFP组细胞在瓣膜支架表面未形成完整的细胞层,可见裸露的瓣膜支架。MTT法和细胞计数示转染Ad.TGF-β1组瓣叶上黏附的细胞数量明显多于对照组和转染Ad.GFP组。（2） TEHV的体外冲刷实验后,细胞计数和MTT示实验组中对照组和转染Ad.GFP组在遭遇高流速液体冲刷后的细胞数少于转染Ad.TGF-β1组（P＜0.05）。实验组与静态组相比前组细胞数少于后组（P＜0.05）,提示该实验有检验细胞黏附力的价值。同时HE染色示对照组和转染Ad.GFP组冲刷实验后细胞存留较少;转染Ad.TGF-β1组瓣膜表面存留细胞密度多于对照组,细胞与基质黏附较紧密。四、结论1、构建的Ad.TGF-β1,其转染效率高、毒性低,安全性好。2、BMSCs作为种子细胞较为理想,优点为增殖能力强,而且易获取,创伤小,可行性强。Ad.TGF-β1在体外能有效转染BMSCs,TGF-β1基因能有效地表达。3、转染Ad.TGF-β1能促进BMSCs增殖和基质分泌,增强与去细胞猪主动脉瓣支架的黏附。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、研究背景
• 二、课题总体设计
• 参考文献
• 第一部分:TGF-β1基因重组腺病毒载体Ad.TGF-β1的构建
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• 第二部分:BMSCs的分离、培养、鉴定及Ad.TGF-β1转染BMSCs后TGF-β1蛋白表达、分泌
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• 第三部分:转染TGF-β1基因增强BMSCs黏附力的研究
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述:组织工程心脏瓣膜的研究进展
• 致谢
• 在读期间撰写及发表论文情况