大孔吸附树脂吸附分离家蝇抗菌肽的研究

论文摘要

昆虫抗菌肽是昆虫免疫防御系统的重要成分,具有相对分子质量小、热稳定性好、抗菌谱广等特点。家蝇存在独特的免疫机制,在我国分布广,资源丰富,容易养殖、成本低,是一个等待开发的良好资源。因此对家蝇抗菌肽分离纯化的研究具有重要理论意义和实际应用价值。家蝇抗菌肽的抑菌活性与其疏水性有一定的联系,故采用大孔吸附树脂根据疏水性的差异来从家蝇粗蛋白中分离家蝇抗菌肽,并对大孔吸附树脂的分离工艺进行了优化选择,然后通过RP-HPLC进一步纯化,得到了抑菌活性最高的组分。本论文考察多种大孔吸附树脂对家蝇蛋白的吸附性能,D101大孔吸附树脂对家蝇蛋白的吸附量可达217.18 mg/g,乙醇是比较理想的洗脱剂,随着乙醇的浓度增加,洗脱率也相应提高,当用75%乙醇洗脱时,洗脱率为75.70%。通过试验确定D101大孔吸附树脂富集分离家蝇抗菌肽的上样条件为:上样流速0.5 BV/h（BV, Bed Volume,床体积）,上样浓度为15 mg/mL。D101大孔吸附树脂富集分离洗脱采用15%、35%和55%的乙醇分级洗脱,经过这三种浓度的乙醇溶液洗脱后得到的组分的蛋白质含量分别为39.40%、71.72%和72.74%,而粗家蝇蛋白的蛋白质含量只有12.79%,说明洗脱后的蛋白质的含量有很大的提高,同时其疏水性值也从粗家蝇蛋白的4.17 kJ/mol分别增加到了4.30 kJ/mol、4.43 kJ/mol和4.75 kJ/mol。随着疏水性的提高,家蝇抗菌肽的抑菌活性也呈现增加的趋势,其中55%乙醇洗脱组分的抑菌活性最高。经过分离纯化使用后的树脂再吸附性能降低,用常规的再生方法不能恢复大孔吸附树脂的吸附能力,研究分别采用酸醇法和碱醇法对D101大孔吸附树脂再生条件进行优化:酸醇法对D101大孔吸附树脂的静态再生条件为HCl浓度0.1 mol/L,乙醇浓度85%,温度30℃,浸泡时间6 h,再生液用量50 mL/g干树脂;动态再生条件为再生液流速1 BV/h,再生液用量66.7 mL/g,其他条件同静态再生。碱醇法对D101大孔吸附树脂的静态再生条件为NaOH浓度0.1 mol/L,乙醇浓度85%,温度为30℃,浸泡时间6 h,再生液用量66.7 mL/g干树脂;动态再生条件为再生液流速为1 BV/h,其他条件同静态再生。在上述条件下,同时使用酸醇法和碱醇法对D101大孔吸附树脂进行再生,使用20次后树脂的吸附性能仅降低1.5%。对D101大孔吸附树脂富集分离的55%乙醇洗脱组分进一步进行RP-HPLC纯化,得到的多个峰都具有抑菌活性,其中F12的抑菌活性最高。经过二次RP-HPLC和SDS-PAGE电泳检测,该峰达到色谱纯和电泳纯,测得其相对分子质量为4842。氨基酸分析表明,F12富含碱性氨基酸和疏水性氨基酸,疏水性值为5.82 kJ/mol。与D101大孔吸附树脂分离组分相比,F12的疏水性增加更为明显,其抑菌活性也有大幅度的提高。测定各种组分对各试验菌的MIC（Minimal Inhibitory Concentration,最低抑菌浓度）可以知F12对大肠杆菌的MIC最低,为30μg/mL。同时,试验证明F12具有良好的耐高温、耐低温和耐酸碱性,F12在pH 9左右抑菌活性最大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 家蝇抗菌肽
• 1.2.1 蝇源抗菌肽的分类及特点
• 1.2.2 家蝇抗菌肽的来源
• 1.2.3 家蝇抗菌肽分离纯化方法研究进展
• 1.3 大孔吸附树脂
• 1.3.1 大孔吸附树脂的特点
• 1.3.2 大孔吸附树脂分离蛋白质和多肽的研究进展
• 1.4 立题背景与意义
• 1.5 本课题研究内容
• 第二章 大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽的吸附与富集
• 2.1 前言
• 2.2 试验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料与主要试剂
• 2.2.2 实验主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白质浓度测定方法
• 2.3.2 家蝇粗蛋白主要组成成分的分析
• 2.3.3 家蝇粗蛋白预处理
• 2.3.4 大孔吸附树脂预处理
• 2.3.5 不同大孔吸附树脂静态吸附试验
• 2.3.6 不同大孔吸附树脂静态解吸试验
• 2.3.7 不同洗脱剂对D101 大孔吸附树脂的解吸试验
• 2.3.8 D101 大孔吸附树脂静态吸附动力学试验
• 2.3.9 D101 大孔吸附树脂动态吸附和解吸试验
• 2.3.10 不同离子强度对D101 大孔吸附树脂吸附性能的影响
• 2.3.11 D101 大孔吸附树脂分级纯化家蝇抗菌肽试验
• 2.3.12 氨基酸分析
• 2.3.13 蛋白质或肽的疏水值的计算
• 2.3.14 抑菌活性的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 Folin-酚法标准曲线的绘制
• 2.4.2 家蝇粗蛋白样品的预处理
• 2.4.3 大孔吸附树脂的筛选
• 2.4.4 合适的洗脱剂的选择
• 2.4.5 D101 大孔吸附树脂对家蝇蛋白的静态吸附动力学试验
• 2.4.6 D101 大孔吸附树脂对家蝇蛋白的动态吸附
• 2.4.7 D101 大孔吸附树脂对家蝇抗菌肽的分级纯化
• 2.4.8 D101 大孔吸附树脂各分离组分的抑菌活性检测
• 2.5 本章小结
• 第三章 D101 大孔吸附树脂的再生条件选择
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料与仪器
• 3.2.1 材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 使用前后D101 大孔吸附树脂的吸附性能测定
• 3.3.2 酸醇法再生单因素试验
• 3.3.3 碱醇法再生单因素试验
• 3.3.4 D101 大孔吸附树脂再生影响的静态再生正交试验
• 3.3.5 D101 大孔吸附树脂再生影响的动态再生正交试验
• 3.3.6 D101 大孔吸附树脂重复再生稳定性试验
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 使用前后D101 大孔吸附树脂的吸附性能的变化
• 3.4.2 酸醇法再生单因素试验
• 3.4.3 碱醇法再生单因素试验
• 3.4.4 D101 大孔吸附树脂静态再生条件的优化选择
• 3.4.5 D101 大孔吸附树脂动态再生条件的优化选择
• 3.4.6 重复再生对D101 大孔吸附树脂吸附性能稳定性的影响
• 3.5 本章小结
• 第四章 家蝇抗菌肽的纯化与活性检测
• 4.1 前言
• 4.2 试验材料与仪器
• 4.2.1 材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 RP-HPLC 对大孔吸附树脂55%乙醇洗脱组分的纯化
• 4.3.2 RP-HPLC 纯化各组分的抑菌活性测定
• 4.3.3 二次RP-HPLC 检测纯度
• 4.3.4 SDS-PAGE 电泳分析
• 4.3.5 RP-HPLC 分离活性组分的相对分子质量分布测定
• 4.3.6 氨基酸组成分析
• 4.3.7 稀释法药敏试验测定最低抑菌浓度
• 4.3.8 耐低温试验
• 4.3.9 耐酸碱性试验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 RP-HPLC 对大孔吸附树脂55%乙醇洗脱组分的纯化
• 4.4.2 RP-HPLC 各分离组分的抑菌活性测定
• 4.4.3 F12 二次RP-HPLC 检测
• 4.4.4 F12 SDS-PAGE 电泳分析
• 4.4.5 F12 的相对分子质量测定
• 4.4.6 F12 的氨基酸组成分析
• 4.4.7 F12 最低抑菌浓度的测定
• 4.4.8 F12 耐低温试验
• 4.4.9 F12 耐酸碱性试验
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文