棕色固氮菌突变株DJ35中钼铁蛋白和HBP59蛋白的研究—纯化、特性及晶体生长——NULL

论文题目: 棕色固氮菌突变株DJ35中钼铁蛋白和HBP59蛋白的研究—纯化、特性及晶体生长——NULL

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 边少敏

导师: 黄巨富

关键词: 棕色固氮菌突变种,纯化和特性,可见光谱,圆二色谱,晶体生长,血红素

文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 我们从A. vinelandii突变株DJ35中纯化得到了△nifE Av1并通过与OP Av1相比较对其特性进行了研究虽然△nifE Av1以四聚体形式（ 2 2）存在但却表现出两种天然电泳行为与OP Av1相比△nifE Av1中的金属含量较低每个蛋白分子仅含9.96个铁原子0.36个钼原子OP Av1和△nifE Av1的吸收光谱相似均在280 nm附近出现蛋白吸收峰在300-600 nm波长范围内光吸收普遍降低并无特征峰出现虽然△nifE Av1可见光区域CD谱的摩尔消光系数总比OP Av1小但在520 nm区域附近摩尔消光系数减少的相对值明显大于在450 nm附近摩尔消光系数减少的相对值△nifE Av1的EPR信号明显与OP Av1不同在g≈3.7处的EPR信号完全消失在g≈4.3和2.0处的EPR信号强度也分别降低了75%和50%以上△nifE Av1不能与Fe蛋白组成活性单位但被FeMoco激活后可与Fe蛋白组成活性单位除此之外我们还对△nifE Av1和△nifH Av1的结晶条件进行了筛选并得到了优质小单晶上述结果表明,△nifE Av1不含FeMoco但具有与OP Av1相同的P-cluster 我们在纯化△nifE Av1的过程中发现一个类似OP Av1的β亚基的污染蛋白经MALDI-TOF质谱鉴定这种蛋白是棕色固氮菌中一预测基因的产物我们探索出一种纯化方法并首次得到80%电泳纯的蛋白将其命名为HBP59蛋白HBP59为一单体蛋白分子量约为59 kDa金属测定结果表明每个蛋白分子中含有0.42个铁原子HBP59蛋白的可见光谱表现出典型的血红素蛋白光谱特征还原态的HBP59蛋白在421 nm处有最大吸收峰同时在517 nm 556 nm处有两个伴随肩峰出现A421/A280仅为0.146 HBP59蛋白氧化后吸收峰发生蓝移最大吸收峰从421 nm移到413 nm 517 nm和55 nm处的肩峰消失A413/A280为0.168 HBP59蛋白的可见光区圆二色谱比较复杂正峰出现在420 nm, 406 nm, 379 nm和364 nm; 其摩尔消光系数分别为0.75 M-1cm-1 0.94 M-1cm-1 0.68 M-1cm-1和0.99 M-1cm-1负峰出现在433 nm和392 nm其摩尔消光系数分别为-1.13 M-1cm-1和-0.78 M-1cm-1血红素滴定实验结果说明每个HBP59蛋白分子结合了0.1个血红素但每个蛋白分子具有最大结合1个血红素的能力该蛋白对温度相对敏感高于40蛋白开始沉淀除此之外我们还对HBP59的晶体培养进行了初步探索上述结果说明HBP59是一个结合血红素的蛋白它在菌体内可能并未扮演贮藏血红素的角色而是可能参与血红素的运输或附着

论文目录:

摘要

Abstract

第一章前言

1.1 突变株固氮酶研究进展

1.1.1 固氮酶的组成

1.1.2 固氮菌突变株研究的意义

1.1.2.1 利用突变株研究固氮酶的合成过程

1.1.2.2 利用突变株揭示固氮酶的作用机理

1.1.2.3 利用突变株探索新型固氮酶

1.1.3 突变株的种类

1.1.4 突变株研究进展

1.1.4.1 氨基酸发生改变的突变株

1.1.4.2 FeMoco发生改变的突变株

1.1.4.3 P-cluster 发生改变的突变株

1.1.5 新型固氮酶的研究进展

1.2 血红素利用研究进展

1.2.1 血红素的合成

1.2.2 血红素的利用

1.2.3 血红素蛋白的作用

1.2.4 血红素蛋白的理化特性

1.3 立题依据

1.3.1 △nifE Av1 研究

1.3.2 HBP59 蛋白研究

第二章材料与方法

2.1 棕色固氮菌的培养

2.1.1 培养基配制

2.1.1.1 母液配制

2.1.1.2 应用液配制

2.1.2 菌体培养

2.1.2.1 斜面培养

2.1.2.2 摇瓶培养

2.1.2.3 小罐发酵

2.1.2.4 菌体收集

2.1.3 菌体生长及活性测定

2.1.3.1 菌体浓度检测

2.1.3.2 突变种在限氨培养基中耗氨情况的检测

2.1.3.3 菌体活性检测

2.2 厌氧技术

2.2.1 氩气的纯化

2.2.1.1 除氧溶液的配制

2.2.1.2 除氧溶液的使用

2.2.2 厌氧操作要点

2.3 △nifE Av1 和HBP59 的分离纯化

2.3.1 含不同盐浓度的厌氧Tris-HCl缓冲液的配制

2.3.2 △nifE Av1 的分离纯化

2.3.3 HBP59 的分离纯化

2.4 蛋白质浓度测定

2.4.1 浓度测定

2.4.1.1 试剂配制

2.4.1.2 标准曲线制作

2.4.1.3 样品蛋白浓度测定

2.5 蛋白质电泳及Western-blotting

2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.5.1.1 电泳试剂配制

2.5.1.2 不同染色方法试剂配制

2.5.1.3 染色步骤

2.5.2 Western-blotting 免疫印渍

2.5.2.1 试剂配制

2.5.2.2 电印渍步骤

2.5.2.3 检测

2.5.3 凝胶成像扫描及干胶制作

2.6 固氮酶活性测定

2.6.1 Mg-ATP 发生系统的配制

2.6.2 FeMoco 的抽提

2.6.3 C2H2 还原和放氢活性测定

2.7 蛋白金属含量测定

2.8 质谱分析

2.9 吸收光谱和圆二色谱的测定

2.10 电子顺磁共振谱测定

2.11 蛋白质结晶

2.11.1 溶液配制

2.11.2 结晶方法

2.11.3 晶体回收鉴定

2.11.3.1 离心法回收晶体

2.11.3.2 挑取晶体法回收晶体

第三章结果与分析

3.1 △nifE Av1 的纯化特性及晶体生长研究

3.1.1 △nifE Av1 的分离纯化

3.1.2 △nifE Av1 的特性

3.1.2.1 亚基组成

3.1.2.2 FeMoco激活特性

3.1.2.3 金属组成特性

3.1.2.4 △nifE Av1 的光谱特性

3.1.2.5 △nifE Av1 的EPR 特性

3.1.3 △nifE Av1 和△nifH Av1 结晶研究

3.1.3.1 △nifE Av1 和△nifH Av1 晶体生长

3.1.3.2 晶体鉴定

3.2 HBP59 蛋白的纯化特性及晶体生长研究

3.2.1 HBP59 的纯化和鉴定

3.2.2 HBP59 蛋白的特性

3.2.2.1 蛋白的亚基组成和分子量

3.2.2.2 金属组成

3.2.2.3 吸收光谱特征

3.2.2.4 圆二色谱特征

3.2.2.5 血红素结合特性

3.2.2.6 HBP59 对温度 O_2 和pH 的稳定性

3.2.3 HBP59 蛋白结晶

第四章讨论

4.1 △nifE Av1 的纯化特性及晶体生长研究

4.2 HBP59 的纯化特性及晶体生长研究

第五章研究进展与展望

5.1 研究进展

5.1.1 △nifE Av1和△nifH Av1的纯化特性鉴定和结晶

5.1.1.1 蛋白质纯化

5.1.1.2 蛋白质的特性鉴定

5.1.1.3 蛋白质的晶体生长

5.1.2 HBP59 的分离纯化特性鉴定和结晶

5.1.2.1 纯化

5.1.2.2 鉴定

5.1.2.3 结晶

5.2 研究创新

5.3 研究展望

参考文献

缩略语

论文

致谢

发布时间: 2006-04-30

参考文献

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