不同启动子RNA干扰载体构建及验证

论文摘要

RNA干扰作用（RNA interference,RNAi）是由双链RNA（dsRNA）引发的转录后基因沉默,主要是指dsRNA分子进入细胞内,特异性降解与之同源的mRNA,从而特异高效地抑制相应基因表达的现象。为建立稳定的RNAi系统,本论文选择不同类型的启动子构建针对RED（红色荧光）基因的RNA干扰载体,并在HeLa细胞中验证本系统的可行性,为实现组织特异RNA干扰提供了技术支持,并且提供了一个生产转基因毛用动物的新思路。一RNA干扰载体的构建利用PCR方法分别从pcDNA3.1（+/-）载体克隆CMV启动子,从pGL3-K5质粒克隆角蛋白5（Keratin5,K5）基因启动子,从绵羊cDNA克隆角蛋白关联蛋白（Keratin associated protein6.1,KAP6.1）基因启动子,从小鼠基因组扩增超高硫蛋白（Ultra-high-sulfur Keratin Protein,UHS）基因启动子,经pMD19-T载体连接,构成中间载体。同时将中间载体和pGenesil-1载体进行双酶切,纯化回收,连接,转化。克隆到与目的片段大小相一致的CMV启动子、K5、KAP6.1和UHS基因启动子（大小分别为660bp.870bp.1052bp和580bp）。成功构建了CMV-pGenesil-1、K5-pGenesil-1、 KAP6.1-pGenesil-1和UHS-pGenesil-1过渡载体。从3个shRNA表达载体上克隆得到shRNA目的片段,将扩增得到的目的片段与构建成功的过渡载体同时进行酶切、纯化回收、连接、转化。成功扩增到3个shRNA目的片段,大小分别为115bp.116bp和117bp,并将其与构建的过渡载体连接。经测序分析后,结果显示成功构建了15个针对RED基因的RNA干扰载体。二干扰载体表达的检测为验证构建的15个针对RED的干扰载体在HeLa细胞中是否能抑制RFP（红色荧光蛋白）的表达。将15个干扰载体分为6组转染HeLa细胞,每组转染实验重复4次,以只表达红色荧光的CMV-Red质粒作为对照组,转染48h后,荧光显微镜下观察RFP的表达变化,并利用RT-PCR与荧光定量PCR技术检测抑制效率。结果显示与对照组相比,15个干扰载体都产生了干扰作用,其中抑制效率最高的达90%以上。将K5驱动的shRNA1干扰载体转染进稳定表达红色荧光的绵羊成纤维细胞内,转染48h后,荧光显微镜下检测红色荧光和绿色荧光的表达。绵羊胎儿成纤维细胞中检测到绿色荧光的表达,表明干扰载体转染进绵羊胎儿成纤维细胞内；红色荧光的表达有所下降,表明K5驱动的RNA干扰载体产生了抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略符号
• 文献综述
• 1 影响羊毛生产的因素
• 1.1 遗传因素
• 1.2 环境因素
• 2 转基因技术在畜牧生产中的应用
• 2.1 毛纤维质量和产量的改良
• 2.2 乳腺生物反应器
• 3 转基因技术应用存在的问题
• 4 启动子与报告基因
• 4.1 启动子的结构
• 4.2 报告基因
• 5 RNA干扰（RNAi）
• 5.1 RNA干扰的发现
• 5.2 RNA干扰的主要特征
• 5.3 RNA干扰的分子模型
• 5.4 RNA干扰的作用机制
• 5.5 RNA干扰实现的技术路线
• 5.6 RNA干扰的应用
• 5.7 RNA干扰技术存在的问题和发展趋势
• 6 本课题研究的目的和意义
• 第一章 RNA干扰载体构建
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 试验结果
• 2.1 启动子PCR扩增
• 2.2 pMD19-T启动子重组载体构建
• 2.3 shRNA PCR扩增
• 2.4 pGenesil-1酶切检测
• 2.5 构建干扰载体的检测
• 3 讨论
• ABSTRACT
• 第二章 干扰载体表达的检测
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 HeLa细胞系的培养
• 2.2 总RNA的提取
• 2.3 半定量RT-PCR的结果
• 2.4 荧光定量PCR检测RFP的抑制效率
• 2.5 各干扰载体的荧光定量PCR检测
• 3 讨论
• ABSTRACT
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文